Литераторы, которые были главным украшением двора Рене, начали покидать Феррару. В числе первых были Челио Курионе и Иоанн Синапи, учителя и друзья Олимпии.
В 1552 году принц Альфонсо, старший сын Рене, узнав о войне между Генрихом II и императором, проявил желание принять в ней участие. Но он напрасно просил разрешения у своего отца. Поэтому, взяв взаймы у различных лиц сумму в девять тысяч скудо, принц тайно отправился в Париж. Альфонсо был с большим почётом встречен своим кузеном Генрихом II, который наградил его Орденом Святого Михаила и дал ему отряд из ста человек, заранее выплатив пенсию, чтобы обеспечить его потребности. Этот шаг со стороны его сына и наследника вызвал сильное огорчение Эрколе, чьим главным желанием было избежать последствий гнева грозного императора. Потерпев неудачу в своих попытках поймать принца и доставить его обратно в Феррару, герцог приказал повесить за одну ногу перед окнами Палаццо делла Раджоне чучело Джио Томмазо Лавеццуоло, который посоветовал Альфонсо бежать во Францию. Более того, Эрколе II предложил награду за поимку преступника, живого или мёртвого.
Ситуация была очень сложной для него и выгодной для Генриха II, который мог — при необходимости — использовать молодого человека в качестве заложника. Оказалось, что Рене тоже принимала в этом участие: она заранее сообщила о прибытии сына королю и позаботилась об его хорошем приёме при дворе. Таким образом, гнев герцога был направлен как на его жену, так и на сына.
Действительно, Генрих II воспользовался ситуацией. В начале 1553 года в Феррару прибыл Субиз, который привёз Эрколе II письмо от короля: тот решил создать вместе с папой Лигу против испанцев и предлагал герцогу присоединиться к этому союзу. Затем Жан де Партене должен был отправиться с той же целью в Парму.
Рене с радостью приняла старого друга, вручившего ей в качестве подарка большое фаянсовое блюдо с разноцветной глазурью.
—Какая красота! Неужели его сделал французский мастер?
—Да, мадам. Эта вещь работы мастера Бернарда Палиси, нашего единоверца, который живёт в собственном доме на окраине Сента. Его «сельские глины» очень ценятся при дворе.
Пока гость рассказывал о знаменитом гончаре, принцесса не сводила глаз с его подарка. Её муж собрал бесценную коллекцию произведений искусства, но блюдо Палиси было Рене дороже их всех. Ведь его сделал ремесленник, которому покровительствовал Антуан де Пон!
—Я слышала, Вы собираетесь жениться, месье де Субиз?— спросила она спустя некоторое время.
Жан смущённо улыбнулся:
—Мне уже за сорок, мадам, и, я думаю, пришло время создать свою семью.
—И кто же Ваша избранница?
—Мадемуазель д’Обетер, фрейлина королевы.
—Надеюсь, она разделяет нашу веру?
—Да, Антуанетта склоняется к нашей религии. Мы договорились с ней, что когда поженимся, она будет заниматься домом и детьми, а я — служить нашему повелителю.
Открыто не объявляя о своих религиозных взглядах, Субиз считался другом короля и пользовался значительным влиянием при дворе. Однако вскоре после смерти Генриха II он сообщил вдовствующей королеве Екатерине Медичи о том, что отвергает мессу, и покинул двор. Пытаясь вернуть его, флорентийка пообещала Жану де Партене щедрую пенсию и даже послала ему Орден Святого Духа, но ничего не добилась. Он с большим рвением стал распространять протестантскую веру, а когда началась первая религиозная война, возглавил гарнизон Лиона, прославившись своей активностью и благоразумием. Его дочь и наследница Катрин де Субиз стала знаменитой писательницей и математиком.
В отличие от Субиза, Рене не скрывала свою приверженность кальвинизму. Ходили слухи, что герцогиня намеревалась воспитать своих дочерей в реформаторской вере и с этой целью попросила в 1550 году Кальвина прислать в Фреррару опытного проповедника. Тайно прибывший пастор Поскьяво произнёс тринадцать проповедей и, вероятно, побудил герцогиню провести Евхаристию (причастие) по кальвинистскому обряду. Причём во время этой «Тайной Вечери» присутствовала не только Рене, но и её дочери Лукреция и Элеонора. А в марте 1554 года герцогиня, не посещавшая придворных месс, выступила против присутствия дочерей на пасхальных торжествах.
Узнав о том, что она не ходит к исповеди и на мессу, новый папа Юлий III, в свой черёд, обратился к Эрколе с просьбой повлиять на жену. 18 марта 1554 года герцог издал указ, запрещающий въезд в его государство всем лицам, подозреваемым в содействии ереси.
Невзирая на преданность интересам Франции, отношения с племянником, новым королём, у Рене складывались не столь хорошо, как это было с Франциском I. Её письма к коннетаблю Анну де Монморанси, фавориту двух королей, свидетельствуют о многочисленных задержках сумм, которые выплачивалась герцогине с её земель: она просит вернуть ей ренту за прошлый год, за последние шесть месяцев или за последние два года:
—Я (не могу) найти способ содержать себя, и, несмотря на необходимость, я испытываю невыносимую скуку и сожаление по поводу того, насколько я недовольна тем, что вижу…
Финансовые трудности можно было преодолеть только с помощью займов и благодаря вмешательству Эрколе II, который был не в восторге от этого. Таким образом, система приданого, выплачиваемого в виде ренты, имела два основных недостатка: она ставила принцессу одновременно в зависимость и от короля Франции, и от мужа.
Между тем близился час, когда Рене должна была сделать окончательный выбор между старой и новой религией. Подстрекаемый своим духовником, иезуитом Жаном Пеллетье, Эрколе решил действовать через Генриха II. 27 марта он дипломатично написал королю Франции о своей обеспокоенности по поводу религиозных воззрений своей супруги:
—Мадам Рене, когда прибыла в Феррару, неукоснительно соблюдала принципы религии благодаря безупречному воспитанию, которое она приобрела при христианнейшем дворе… Постепенно, она сблизилась с недовольными лютеранами. На Рождество мы не слышали мессу во дворце мадам, её дочери воспитаны в ложной религии, а еретическая репутация их матери распространилась по всей Италии.
Таким образом, Эрколе II снял с себя всю ответственность за реформаторские взгляды своей жены.
В ответ король поручил Мэтью Ори, великому инквизитору Франции, допросить Рене и не возвращаться домой, пока не вернёт её в лоно католической церкви, «принимая во внимание великие милости, которые Бог даровал ей, и среди прочего то, что она является потомком чистейшей крови самого христианского дома Франции, где никогда не существовало чудовищ».
Жан Ле Лабурьер, священник и историк ХVII века, также сообщает в примечаниях к «Мемуарам Кастельно» подробности об инструкциях, данных королём своему посланнику:
—Доктор Ори должен вручить месье герцогу Феррарскому письма, которые упомянутый король написал ему собственноручно, и сообщить ему, что он получил прямое указание от Его Величества сделать всё, что в его силах, в деле, для которого он направлен. После этого он поймёт, что ему нужно будет сделать, вступив в беседу с мадам герцогиней, чтобы вернуть её в лоно Иисуса Христа.
