Сделать разрез в нужном месте – это только первая половина работы. Вторая половина заключается в том, чтобы убедить клетку заменить в процессе починки только что поврежденного фрагмента ДНК слоновью версию участка геномной последовательности на мамонтовую.
В норме обрыв обеих нитей ДНК приводит к гибели клетки. Если же оборвалась только одна, ремонтные механизмы клетки могут восстановить любой недостающий участок, используя в качестве шаблона вторую нить. Если оборвались обе цепочки, не так очевидно, откуда клетка узнает, чем ей заменить утраченную последовательность.
Для решения этой проблемы в процессе эволюции возникло два механизма клеточной репарации. Первый называется гомологической рекомбинацией. Поскольку у каждой хромосомы в клетке существует гомологичная копия (одна хромосома от отца, другая – от матери), одну из них можно использовать в качестве шаблона для исправления ошибок в другой. При гомологической рекомбинации две гомологичные хромосомы выстраиваются друг напротив друга, позволяя механизмам клеточной репарации использовать генетическую последовательность неповрежденной хромосомы как образец для ремонта поврежденного участка. При вырезке и вставке мы пытаемся использовать этот механизм в своих целях. Одновременно мы хотим обмануть клетку, заставив ее вместо гомологичной хромосомы использовать в качестве шаблона синтезированный фрагмент ДНК (в нашем случае участок ДНК мамонта, доставленный в клетку вместе с молекулярными ножницами).
Второй механизм репарации двунитевых разрывов называется негомологичным соединением концов. Для работы этого механизма не требуется наличия гомологичной последовательности в качестве шаблона для репарации участка ДНК, вместо этого оборванные концы просто склеиваются между собой. Это не тот путь, по которому клетка должна пойти, если мы хотим изменить последовательность ДНК, но клетки часто используют такой механизм. Следовательно, одна из оставшихся трудностей заключается в том, чтобы разработать способ контролировать то, какой из механизмов будет задействован для репарации ДНК. Но пока что только часть отредактированных клеток получит новую версию гена, помещенную в нужное место в процессе репарации.
Нуклеазы ZFN и TALEN заслужили право считаться невероятно мощными молекулярными инструментами. Нуклеазы ZFN используются для исправления мутаций, вызывающих генетически обусловленные заболевания у людей, путем прямого редактирования геномной последовательности в стволовых клетках пациента. Эти модифицированные стволовые клетки затем можно пересадить пациенту, и они будут действовать как лекарство. Нуклеазы ZFN используются даже в разработке средства от ВИЧ/СПИД, при этом ген CCR5, кодирующий белок, с помощью которого ВИЧ проникает в Т-лимфоциты, редактируют таким образом, что вирус больше не может его использовать. Редактирование генома также используется для вставки генов устойчивости к гербицидам в геномы кукурузы и табака, а также для изменения коровьего генома таким образом, чтобы у коров вырабатывались человеческие версии различных белков крови и молока.
Применение ZFN и TALEN для редактирования геномов ограничено в основном необходимостью определять для них специфическую цель в геномной последовательности, что оказалось довольно сложно контролировать. При использовании более длинных зондов, созданных путем соединения большего количества «цинковых пальцев» или TALE, увеличивается специфичность, но более длинные белковые молекулы сложнее доставлять в клетку. Кроме того, создание зондов – это сложный процесс, требующий кропотливой работы, и на нее зачастую уходят месяцы и годы проб и ошибок. Со всеми этими проблемами мы уже сталкиваемся при работе с организмами, эксперименты с которыми давно ведутся в лабораториях молекулярной биологии. Если мы решим применить эти методы для восстановления вымерших видов, в экспериментах будут участвовать организмы, геномные последовательности которых нам неизвестны, на которых никогда не проводились исследования в области молекулярной биологии, что дополнительно увеличит сложность работы. Разумеется, эти инструменты для редактирования генома потенциально можно использовать для возрождения вымерших видов. Однако, глубже разобравшись в механизме их работы, мы вынуждены будем спуститься с небес на землю.
Возрождение вымерших видов с точки зрения CRISPR
Почти одновременно с нашей встречей в Гарварде появился новый экземпляр в наборе инструментов для редактирования генома. Этот новый инструмент, называемый системой CRISPR-Cas9, был открыт, когда ученые обнаружили его роль в формировании иммунитета у бактерий: вначале система считывает последовательность ДНК патогенного организма, а затем обнаруживает эту последовательность и уничтожает ее. Использование той же системы для редактирования генома имеет два ключевых преимущества по сравнению с ZFN и TALEN. Во-первых, программирование механизма происходит намного быстрее – у нас больше нет нужды соединять в цепочки «цинковые пальцы» и TALE методом проб и ошибок. Во-вторых, можно использовать намного более длинные последовательности, что существенным образом повышает их специфичность. Относительная простота, с которой можно редактировать геном при помощи этой системы, позволяет предположить, что в скором будущем биологию ожидает еще одна революция, подобная той, которая разразилась после изобретения ПЦР.
Вот как это работает. Когда болезнетворный микроорганизм проникает в клетку бактерии или простейшего, его геном опознается клеткой и разрезается на мелкие кусочки. Некоторые из них захватываются в качестве «спейсеров» молекулой, называемой CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats – короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами). Таким образом эти фрагменты патогенных микроорганизмов встраиваются в бактериальный геном и сохраняются для использования в будущем. Чтобы защитить себя от проникающих в нее патогенов, клетка транскрибирует CRISPR и разрезает ее в местах повторов, высвобождая спейсеры, которые, как мы помним, представляют собой участки ДНК болезнетворного микроорганизма. Транскрибированные спейсеры захватываются белками Cas9, которые затем ищут внутри клетки фрагменты ДНК, соответствующие спейсерам, чтобы обнаружить и уничтожить проникшие в клетку патогены.
Чтобы понять, как систему CRISPR-Cas9 можно использовать для редактирования генома, представьте, что, вместо того чтобы захватывать кусочки ДНК патогена и искать с их помощью болезнетворные микроорганизмы, которые могли проникнуть в клетку, молекулы Cas9 связываются с созданным нами участком ДНК и ищут с его помощью ту часть генома, которую мы хотим отредактировать (рис. 11). Этот способ определения специфических участков генома становится все более эффективным и точным. Мы проектируем и синтезируем молекулы CRISPR РНК (или cгРНК), которые представляют собой аналоги соединенных вместе «цинковых пальцев» или TALE, для поиска нужного нам участка генома. Когда cгРНК находит этот участок, Cas9, аналог молекулярных ножниц в ZFN и TALEN, разрезает нить ДНК. После этого начинаются стандартные процессы репарации ДНК и (мы надеемся) наши правки встраиваются в геномную последовательность.
Помимо выигрыша в скорости и специфичности, система CRISPR-Cas9 также позволяет увеличить эффективность процесса, если мы хотим внести множество изменений за один раз. Белок Cas9 и синтезированные cгРНК не связаны между собой физически, и это означает, что в клетку можно доставить сразу много различных cгРНК. Каждая из них будет захвачена белком Cas9 и использована для обнаружения (и разрыва) разных участков генома.
