Мы были поражены тем, насколько велико разнообразие CRISPR. В 2005 году исследователи идентифицировали девять различных типов иммунных систем CRISPR
[73]. К 2011-му это число снизилось до трех – однако считалось, что в эти обширные типы входит десять подтипов
[74]. А к 2015 году классификация снова поменялась: теперь она состояла из двух обширных классов, включающих шесть типов и девятнадцать подтипов
[75].
Эти открытия поместили наше собственное исследование в общий контекст – и сделали очевидными ограничения нашей работы. Результаты, которые мы получали, изучая E.coli и P. aeruginosa, были справедливы только для двух подтипов систем CRISPR, которые, в свою очередь, входили в категорию иммунных систем CRISPR-Cas I типа. В то время как многие выводы наших исследований были применимы и к другим подтипам систем CRISPR, становилось все сложнее сравнивать наши данные с результатами исследования бактерий с CRISPR-системами II типа, наподобие S. thermophilus – бактерии, благодаря которой образуется йогурт и на примере которой впервые было показано существование основанного на CRISPR иммунитета.
Также нашлись некоторые занятные отличия в том, каким образом разные системы CRISPR-Cas уничтожают ДНК фага. В системах I типа (как у E. coli и P. aeruginosa) фермент Cas3 – те самые механизированные “садовые ножницы” – разрывал ДНК в клочья. Невозможно было даже рассмотреть разрушение ДНК в реальном времени, настолько быстро действовала эта крошечная машина; когда мы попытались наблюдать за реакцией в ходе эксперимента в пробирке, мы разглядели лишь молекулярный хаос, в ходе которого по всему геному фага распадались большие куски ДНК. Система II типа, обнаруженная в S. thermophilus, напротив, была более сдержанной и точной. Канадским ученым Сильвену Мойно и Жозиану Гарно во время работы с командой из Danisco удалось фиксировать состояния геномов фагов из инфицированных клеток, пока они подвергались разрушению иммунной системой CRISPR. В процессе, характерном для более простых нуклеаз, механизм, разрезавший фаговую ДНК в S. thermophilus, больше напоминал ножницы: он работал точно в том месте, где “буквы” вирусного генома совпадали с “буквами” РНК CRISPR.
Хирургическая точность фермента Cas в S. thermophilus впечатляла – однако мы знали о белке в этой системе II типа несравненно меньше, чем о ферменте в системе I типа. Ни один из описанных мной или Блейком белков в машине Cascade, которая в одиночку выполняла нацеливание на ДНК в системе CRISPR E. coli (I тип), не присутствовал в системе S. thermophilus (II тип). Более того, мы не знали точно, каким образом ферменты II типа взаимодействуют с РНК CRISPR для определения места разреза в вирусной ДНК.
Какой фермент был главным оружием в системе II типа, если не Cas3? Благодаря чему происходило нацеливание на ДНК в этой системе – да, благодаря РНК CRISPR, но чему еще? Ответы на эти вопросы помогли бы нам понять, как природа решает одну и ту же молекулярную задачу – разрушение вирусной ДНК – различными путями, и постигнуть, а может быть, даже и “приручить” мощный новый тип бактериальной иммунной системы.
Эта загадочная защитная система, созданная природой, обнаруживала черты, странным образом напоминающие свойства искусственно созданных нуклеаз – программируемых ферментов, разрезающих ДНК; эти ферменты все чаще использовались для внесения изменений в определенные участки ДНК клеток в ходе редактирования генома. Хотя иммунная система CRISPR II типа в S. thermophilus, как оказалось, не редактировала ДНК фага, а просто уничтожала ее, однако способность системы находить и вырезать определенные последовательности ДНК не отличалась – по крайней мере принципиально – от функций уже существующих инструментов для редактирования генома: ZFN и TALEN. Но были также и существенные различия, и два вопроса в особенности беспокоили исследователей CRISPR: что за фермент отвечает за разрезание ДНК в системе II типа и как он работает?
Поскольку я все еще была сосредоточена на системах I типа, меня бы, возможно, и не затянуло в это новое направление исследований, если бы не случайная счастливая встреча с коллегой, чья лаборатория располагалась практически на другом конце света и о чьей работе я лишь читала. Эта случайная встреча вдохновила меня на то, чтобы направить свои усилия на понимание CRISPR в новом свете, и стала началом судьбоносного творческого союза: благодаря этому союзу было открыто удивительное свойство системы CRISPR, о котором раньше мало кто мог подозревать.
Весной 2011 года я отправилась из Беркли в Пуэрто-Рико, чтобы принять участие в ежегодной конференции Американского общества микробиологов. Для ученых подобные конференции – отличный способ познакомиться с коллегами, узнать о новейших достижениях в своей области и отдохнуть от каждодневной лабораторной рутины. Хотя я и не была регулярной участницей этой конференции, на этот раз меня пригласили, чтобы я рассказала о работе моей лаборатории с CRISPR; к тому же я знала, что на конференции будет и Джон ван дер Оост, – к тому времени мы уже дружили и иногда сотрудничали, и я с нетерпением ждала возможности пообщаться лично. Кроме того, мне хотелось получше узнать Пуэрто-Рико. Однажды я уже была на острове в годы моей магистратуры, и мне запомнилось, насколько его чудесные тропические леса и виды на океан напоминают мои родные Гавайи.
Вечером второго дня конференции мы с Джоном заскочили в какое-то кафе, чтобы захватить с собой в аудиторию, где намечалась следующая серия выступлений, по стаканчику кофе. За угловым столиком сидела стильная молодая женщина. Джон представил нас друг другу, и, как только он произнес ее имя – Эммануэль Шарпантье, в моей голове молнией пронеслось воспоминание.
Студенты из моей лаборатории рассказывали мне о восхитительной лекции, которую Эммануэль прочитала в Вагенингене на небольшой конференции, посвященной CRISPR. Я не могла присутствовать там, однако, по словам моих подопечных, доклад Шарпантье был посвящен иммунной системе CRISPR II типа бактерии Streptococcus pyogenes. Поразмыслив, я поняла, что ее статья на ту же тему незадолго до этого была опубликована в журнале Nature
[76] и вызвала вспышку радостного возбуждения в моей лаборатории. До выхода статьи все мы думали, что в каскадах реакций CRISPR участвует всего один вид молекул РНК. Однако Эммануэль и ее коллега Йорг Фогель, уже долгое время изучавшие функции небольших бактериальных РНК в своей лаборатории, по счастливому стечению обстоятельств обнаружили вторую молекулу РНК, которая в некоторых случаях была необходима для выработки РНК CRISPR. Это открытие поразило других исследователей CRISPR, показав, насколько многообразен бактериальный иммунитет, – создавалось впечатление, что эволюция создала своего рода швейцарский армейский нож для борьбы с вирусами.
