Как и в случае с эритроцитами и лейкоцитами, открытие тромбоцитов представляет собой запутанную историю. Впервые их описал в 1842 году французский врач Альфред Донне (1801‒1878), а в 1865 году его открытие повторил немецкий анатом Макс Шульце (1825‒1874), но другие ученые сочли их в силу малых размеров либо остатками разрушающихся эритроцитов или лейкоцитов (тут они в каком-то смысле были правы: как мы уже говорили выше, это «осколки» мегакариоцитов), либо родоначальниками эритроцитов. В 1881 году итальянский биолог Джулио Бидзодзеро (1846‒1901) открыл тромбоциты у амфибий и назвал их маленькими бляшками и кровяными пластинками. Связь кровяных пластинок с тромбозом, обнаруженная Бидзодзеро в ходе экспериментов на животных, привела к признанию тромбоцитов отдельным форменным элементом крови. В русской медицинской литературе в отношении тромбоцитов долгое время употреблялся термин «бляшки Биццоцеро» (так писали его фамилию раньше).
Исследование форменных элементов крови было связано с установлением того факта, что при различных заболеваниях количество и морфологические признаки клеток крови изменяются. Это обстоятельство и предопределяет то, что кровь является самым широко исследуемым первичным биоматериалом в лабораторной диагностике.
Как проводился анализ крови в прошлом веке
Для анализа крови, конечно же, надо было сдать кровь. Обычно брали так называемую капиллярную кровь из мякоти безымянного пальца, предварительно протерев кожу ваткой со спиртом и уколов его скарификатором-копьем (приятного в этом было мало). Это требовало определенных навыков: в зависимости от толщины кожи нужна разная глубина прокола. Первую каплю крови вытирали сухим ватным шариком и приставляли к ранке по очереди капилляр Панченкова и несколько пипеток, из которых набранную кровь выдували в подготовленные пробирки. И в довершение всего каплю крови наносили на сухое предметное стекло, а затем шлифовальным стеклом размазывали тонким равномерным слоем для приготовления мазка. Забор крови из вены, не имевший таких ограничений по объему пробы и не вносивший искажения в состав анализируемой крови, как при заборе из пальца, был более сложным делом и назначался реже.
Для определения скорости оседания эритроцитов (СОЭ) кровь из капилляра Панченкова выдували в пробирку (или часовое стекло), частично заполненную 5 %-ным раствором цитрата натрия, затем образующуюся смесь набирали вновь в капилляр, который закрепляли в штативе. Смесь крови и цитрата при стоянии разделяется на плазму и эритроциты. СОЭ (измеряемая в миллиметрах) определяли через час после начала исследования по величине столбика плазмы над осевшими эритроцитами. Сама по себе СОЭ – неспецифический лабораторный показатель, отклонение которого от нормы лишь сигнализирует о патологических процессах.
Для определения гемоглобина использовался гемометр Сали, представлявший собой штатив с тремя гнездами. В крайних гнездах находились ампулы со стандартным раствором с известным содержанием гемоглобина. В среднем гнезде находилась градуированная пробирка, куда пипеткой вносились раствор соляной кислоты и кровь, в результате смешивания которых из гемоглобина образуется гемин, придающий раствору бурый цвет. Содержимое пробирки разводили, прибавляя по каплям дистиллированную воду и перемешивая стеклянной палочкой, пока его цвет не сравняется с цветом стандартного раствора боковых ампул гемометра. Ошибка при определении содержания гемоглобина этим методом могла составлять ±30 %.
Для исследований образцов крови под микроскопом использовали пробирки с разными растворами для разведения: для эритроцитов – с физиологическим раствором (0,9 %-ный раствор поваренной соли); для лейкоцитов – с 3–5 %-ным раствором уксусной кислоты, где эритроциты лизировались (растворялись) и можно было без помех подсчитать все виды лейкоцитов; для тромбоцитов – с 1 %-ным раствором оксалата аммония, тоже вызывающим лизис эритроцитов.
Подсчет клеток под микроскопом проводился с использованием счетных камер. Счетную камеру для подсчета клеток в заданном микрообъеме жидкости и представляющую собой толстое предметное стекло с микроскопической сеткой и прямоугольным углублением (камерой) для жидкости предложил в 1874 году французский анатом Луи-Шарль Малассе (1842‒1909). Наблюдая за несколькими квадратами сетки и зная их площадь и глубину камеры, можно подсчитать количество клеток в определенном объеме жидкости, то есть их концентрацию. В отечественной лабораторной практике использовалась (и до сих пор используется) камера с усовершенствованной сеткой, созданная и предложенная к использованию в 1914 году профессором Казанского университета Николаем Константиновичем Горяевым (1875‒1943), в честь которого это устройство так и называется – камера Горяева, хотя правильнее его называть камерой Бюркера с сеткой Горяева.
Устройство представляет собой толстое предметное стекло с плоской площадкой в центре, углубленной на 0,1 мм. На дне площадки нанесены две сетки, разграниченные поперечной канавкой. Сбоку от сеток расположены стеклянные площадки, к которым притирается шлифованное покровное стекло. После притирания покровного стекла образуется камера, закрытая сверху и с двух боковых сторон, а с двух других сторон остаются щели (капиллярные пространства), через которые камеру и заполняют суспензией. Сетка состоит из 225 больших квадратов, из которых 100 – пустые, 25 разделены каждый на 16 малых квадратов и 100 разделены полосами (самостоятельного значения эти полосы, образующиеся при гравировке малых квадратов, не имеют). Эритроциты считали в пяти расположенных по диагонали сетки квадратах, разделенных на малые, то есть в 80 малых квадратах, а в 100 больших квадратах сетки, не разделенных на малые квадраты и полосы, – лейкоциты, поскольку их на три порядка меньше, чем эритроцитов. Исходя из количества подсчитанных клеток, микрообъема каждого квадрата, степени разведения крови по специальным формулам определяли число клеток в единице объема.
Рис. 7. Счетная камера Горяева (а – вид сверху; б – вид сбоку; в – деление камеры на квадраты; h – глубина камеры)
Метод подсчета тромбоцитов в камере Горяева с применением фазово-контрастного микроскопа является хоть и самым точным, но очень трудоемким, так что часто подсчет тромбоцитов вели в окрашенных мазках крови. В них же измеряли и диаметр эритроцитов, хотя мазки крови в основном брались для исследования лейкоцитарной формулы, то есть процентного состава лейкоцитов каждого вида. Для подобной процедуры требуется окраска мазков.
Окрашивание крови
Перед тем как поместить стекло под микроскоп, мазки крови окрашиваются специальным красителем. Сам метод окрашивания клеток крови, как уже отмечалось, предложил Пауль Эрлих. На эту мысль его натолкнула прочитанная им книга про отравление свинцом, где отмечалась способность этого токсичного элемента накапливаться в определенных тканях. Эрлиха настолько увлекла тема окрашивания биологических тканей, что его научный руководитель представил своего студента светилу бактериологической науки Роберту Коху (1843‒1910), причем следующим образом: «Это маленький Эрлих. Он очень хорошо окрашивает, но никогда не сдаст экзамен». Экзамены Эрлих все же сдал и даже защитил докторскую диссертацию, посвященную окрашиванию биологических структур недавно открытыми синтетическими красителями. Предложенный Эрлихом в 1877 году метод основывался на использовании двух красителей – фуксина и метиленового синего, проявляющих соответственно кислотные и основные свойства. Попытки Эрлиха окрасить клетки крови морских свинок сначала были безуспешными, но как-то раз он отлучился, а подкрашенная капля успела высохнуть, и под микроскопом Эрлих увидел окрашенные клетки; так выяснилось, что следует подкрашивать высохшую кровь. В 1888 году патологоанатом Одесской городской больницы Чеслав Иванович Хенцинский (1851‒1916) предложил использовать для окраски малярийного плазмодия смесь эозина (еще один кислотный краситель) и метиленового синего. Однако такое окрашивание не выявляло ядро плазмодия, и в 1890 году врач Дмитрий Леонидович Романовский (1861‒1921), работавший в петербургском Николаевском военном госпитале, начал экспериментировать с этой смесью и обнаружил, что если применять длительно хранившийся в растворе метиленовый синий, то составной краситель дает полихромную (многоцветную) окраску клеток. Он высказал предположение, что это объясняется наличием какого-то третьего вещества, но, не будучи химиком, ограничился простой догадкой. Вещество, названное азуром, образующееся при окислении метиленового синего, выделил немецкий химик Густав Гимза в 1902 году и наладил серийное производство реактива (эозин-азур-метиленовый синий) под названием «Giemsasche Lözung für die Romanowsky Färbung» («Раствор Гимзы для окраски по Романовскому»), так что метод получил название «Окрашивание по Романовскому‒Гимзе»
[15].
