Так что, когда мы говорим о моноклональных антителах, следует отдавать себе отчет, что это не какой-то чудо-принцип уничтожения враждебных клеток, а технологии производства моноклонального иммуноглобулина, обладающего высокой селективностью (избирательностью) в отношении молекулярной мишени. Для выработки антител, которые содержатся в сыворотках, требуется иммунизация животных, а для получения обычных иммуноглобулинов нужна донорская кровь. Эти препараты в силу особенностей производства содержат широкий спектр антител с различной специфичностью ко многим антигенным детерминантам.
Неудивительно, что, когда был открыт механизм выработки антител в организме, появилась идея использовать антителообразующие клетки (АОК) для производства антител к заданному детерминанту. Как мы уже знаем, клон АОК (потомство исходного В-лимфоцита, реагирующего на антиген) может продуцировать только один вид антител. К сожалению, вытащить АОК из организма и поместить в искусственную питательную среду нельзя – там они погибают. Зато клетки лимфоидной опухоли (миеломы) прекрасно живут и размножаются в пробирке.
В 1975 году Мильштейн и Келер получили гибрид нормальной АОК и опухолевой клетки: для этого они иммунизировали лабораторных мышей антигеном, а когда в их крови появлялись антитела, то из мышиной селезенки готовили раствор, содержащий АОК. Добавив туда клетки миеломы (той же линии мышей), они с помощью полиэтиленгликоля частично растворяли клеточные мембраны и добивались слияния АОК с клеткой миеломы в гибридную клетку – гибридому. Используя селективную питательную среду, избавлялись от оставшихся миеломных клеток, а потом рассеивали гибридомы по лункам иммунологического планшета так, чтобы в каждой лунке оказался лишь один клон. Затем путем тестирования с использованием антигена отбирался клон нужной специфичности и вводился мышам, у которых вырастала опухоль и накапливалась асцитическая жидкость в брюшной полости – источник моноклональных антител.
Понятно, что такой метод нельзя применить к людям для выработки антител. Во-первых, иммунизация людей в большинстве случаев невозможна по этическим соображениям. Во-вторых, источником человеческих АОК может служить лишь периферическая кровь, где их содержание достаточно мало. В-третьих, в случае человеческой гибридомы возникает проблема гистосовместимости клеток миеломы и АОК, тогда как у грызунов используются АОК и клетки миеломы, полученные от одной линии животных. В-четвертых, человеческие гибридомы невозможно нарабатывать в асцитических жидкостях.
Первый препарат, созданный при помощи гибридомной технологии, – Orthoclone OKT3 (муромонаб-CD3) – вышел на рынок в 1986 году и предназначался для снижения иммунного отторжения при трансплантации органов. Свое название он получил в результате сокращения его изначального длинного названия – MURine MONoclonal AntiBody targeting CD3, что переводится как «мышиное моноклональное антитело, распознающее CD3»
[140]. Однако впоследствии у этого препарата выявилось множество побочных эффектов, вызванных ответом иммунной системы пациента на чужеродные мышиные белки, поступающие в организм человека вместе с препаратом
[141].
Следующим шагом стало получение моноклональных антител с сохранением наименьшего количества чужеродного для человека мышиного (или крысиного) материала в препарате.
Это стало возможным благодаря генной инженерии, когда ученые освоили методику изменения кодирующей последовательности генов в ДНК в сторону «очеловечивания» (гуманизации) и внедрили такой измененный генетический материал в культуры клеток яичников китайского хомячка для последующей выработки химерных белков. Химерными они называют потому, что, подобно Химере из древнегреческой мифологии – монстру с головой и шеей льва, туловищем козы и хвостом в виде змеи, – эти белки также состоят из различных частей: из «каркаса» (константной части) человеческих антител, составляющего примерно 70 %, и на 30 % из фрагментов мышиных антител. Первое появившееся на рынке химерное терапевтическое моноклональное антитело – абциксимаб (торговая марка ReoPro), одобренное FDA в 1994 году, – предназначалось для предотвращения агрегации (склеивания) тромбоцитов во время оперативных вмешательств.
Создание химерных антител было шагом к меньшей токсичности, однако их достаточно крупные мышиные фрагменты все же вызывали иммунную реакцию. Поэтому следующим улучшением стало создание гуманизированных антител – с процентным соотношением человеческой и мышиной частей уже 95:5, а затем и полностью человеческих (на 100 %) антител.
Один из способов выработки человеческих антител основан на использовании трансгенных мышей, которые при иммунизации активируют внедренные гены человеческого, а не мышиного иммуноглобулина. И все большее распространение получает так называемый метод фагового дисплея, разработанный американским биологом Джорджем Смитом (род. 1941) и адаптированный британским биохимиком Грегом Уинтером (род. 1951) для направленного отбора антител. За эти работы они удостоились Нобелевской премии по химии в 2018 году.
Основан метод на использовании достаточно простых по устройству вирусов-бактериофагов, размножающихся в бактериальной клетке (кишечной палочке E. coli). Если в участки генома бактериофага, кодирующие белок оболочки вируса, вставить ген, кодирующий пептид (фрагмент белка), то этот пептид будет синтезирован на поверхности бактериофага. Такие генно-модифицированные фаги можно легко выделить из «остальной толпы» благодаря способности связываться с целевым антигеном. В геном бактериофагов можно встраивать не одну целевую последовательность, кодирующую активную часть антитела, а миллионы (например, набор генов антител в человеческих АОК), которые кодируют антитела, получив так называемые фаговые библиотеки. В каком-то смысле фаговые библиотеки являются подобием популяции В-лимфоцитов, каждый из клонов которых производит один вид антител. Выделив из популяции конкретный фаг, обладающий аффинностью к целевому антигену, его можно размножить в бактериальных клетках E. coli, а затем, используя методы генной инженерии, сконструировать на основе целевой последовательности фага набор генов антитела для его выработки, например в культурах клеток яичников китайского хомячка.
Метод фагового дисплея может использоваться в качестве замены гибридом – в таком случае все равно требуется иммунизация животных и забор АОК для создания естественной иммунной библиотеки. Но гораздо большие перспективы (и трудности) сулит использование синтетических библиотек, когда искусственно синтезируют последовательности, кодирующие антитела, не вызывающие иммунную реакцию у человека.
Сейчас практически все препараты основаны на так называемых химерных, или гуманизированных, антителах. Уже одобрено более 80 препаратов на основе моноклональных антител, а общий объем их продаж в 2020 году составил $106,87 миллиарда.
