Первым шагом на пути к нашей цели было узнать, какие именно нейромедиаторы и каким образом используются в сетчатке. Нейроны сетчатки связаны десятками видов синапсов, и мы хотели детально изучить работу этой системы – простимулировать отдельные синапсы и посмотреть, как меняется выходной сигнал сетчатки. Например, существуют ли конкретные нейромедиаторы, отвечающие за передачу только on-ответов или только off-ответов? Какие нейромедиаторы вовлечены в способность сетчатки воспринимать движущиеся стимулы? Не приведет ли это к открытию механизма, который кажется магическим и посредством которого небольшая группа нейронов в сетчатке определяет направление движения стимула?
Сама схема эксперимента была довольно простой. Глядя через микроскоп, я осторожно опускал микроэлектрод, пока его кончик не касался поверхности сетчатки. Если мне везло, ганглионарная клетка издавала легкий хлопок (мы выявляем активность нейронов, усиливая слабый сигнал, улавливаемый микроэлектродом). Если нет, я осторожно перемещал микроэлектрод влево или вправо, внимательно слушая, когда появится отчетливая последовательность электрических разрядов. Когда клетка была надежно изолирована, я включал примитивный оптический стимулятор с воздушным охлаждением, который излучал на сетчатку точечное пятно света. Во время вспышек света я прислушивался к тому, как реагирует клетка. Изучив параметры ее ответа, я вводил через боковой отвод тестовые реагенты и смотрел, изменилась ли реакция. Все это делалось почти в полной темноте, при тусклом красном освещении подобном свету ночника, чтобы минимизировать непреднамеренное раздражение сетчатки. Звуковым фоном служило шипение воздуха в вентиляции и потрескивание фоновых разрядов – нейронного шума.
И да, забыл сказать, что воздух в комнате был нагрет до температуры тела кролика (37,2 ℃). Когда Дел разрабатывал оригинальный эксперимент, он не знал, какие условия необходимы, чтобы ткань оставалась живой вне организма. Ему показалось логичным предположить, что одно из ключевых требований – держать изолированную сетчатку в таких же температурных условиях, которые существуют в кроличьем глазу. Но сетчатка инкубировалась в проточном растворе, в который вводилась струя кислорода. Так как же гарантировать поддержание стабильной температуры в инкубационной чашке? Всегда дотошный, Дел нашел простое решение: создать среду, в которой всё – сетчатка, растворы, воздух – имело температуру тела кролика, 37,2 ℃. По его заказу в лаборатории построили небольшую «теплую комнату», которая нагревалась внешними обогревателями до любой необходимой температуры. Зимой, когда воздух был сухим, находиться 12 часов подряд в крошечной комнатушке, нагретой до 37,2 ℃, не составляло труда. Куда сложнее нам приходилось летом, когда воздух насыщался влагой. (Когда я создал собственную лабораторию, чуть ли первым делом задался целью найти другой способ контролировать температуру.)
В те времена было известно всего несколько видов нейромедиаторов. Как показал грубый химический анализ, все они присутствовали в сетчатке. Заинтригованные, мы решили использовать эти вещества в качестве нейрональных маркеров, которые помогли бы нам идентифицировать клетки. Исходя из предположения, что разные функциональные типы нейронов должны использовать разные нейромедиаторы, мы решили, что изучение действия этих медиаторов укажет нам на то, какие клетки сетчатки выполняют специализированные функции.
Самым хорошо изученным на тот момент нейромедиатором являлся ацетилхолин. Было установлено, что сетчатка содержит чрезвычайно высокий уровень ацетилхолина: его концентрация здесь выше, чем практически в любой другой структуре нервной системы. Предварительные эксперименты Эймса и Дэниела Поллена показали, что некоторые ганглионарные клетки реагируют на действие ацетилхолина. И поскольку этот медиатор открыли довольно давно, уже было разработано множество препаратов, влияющих на опосредованные ацетилхолином синапсы.
Практически сразу я обнаружил, что многие ганглионарные клетки сетчатки действительно возбуждались под действием ацетилхолина или ацетилхолиноподобных веществ. Они показывали стабильный ответ, возбуждаясь не только ацетилхолином, но и агентами, усиливающими его действие. Другие ганглионарные клетки не реагировали на ацетилхолин. Но выявить в их реакциях / отсутствии реакций какую-либо явную закономерность мне не удалось. Я предположил, что on-клетки должны быть более чувствительны к ацетилхолину, чем off-клетки, но экспериментальные данные не дали этому надежного подтверждения (из-за недостатков, как я теперь понимаю, тогдашней системы классификации ответов).
Тогда я решил зайти с другой стороны и выяснить, какие клетки содержат ацетилхолин. По тем временам это была сложнейшая задача, и, если бы не самоотверженная помощь моего друга Джона Миллса, мастера магической техники вмораживания меченого ацетилхолина, я бы вряд ли сумел это сделать. Наградой за наш кропотливый труд стало единственное открытие, что ацетилхолин содержится в одной небольшой группе амакриновых клеток. (Амакриновые клетки – промежуточные нейроны; модифицирующие возбуждение ганглионарных клеток. Дальше я расскажу о них подробнее). Впоследствии эти клетки получили название «звездчатые», потому что их изящная симметричная форма напомнила Теду Фамильетти, нейроанатому с богатым воображением, фейерверк в виде звезд. Оказалось, что именно эти клетки лежат в основе такой замечательной способности ганглионарных клеток сетчатки, как избирательность в отношении направления.
В те же годы я реализовал еще пару небольших исследовательских проектов, но, чтобы сделать наши главные открытия, нам потребовалось почти семь лет непрерывной работы.
ПУТЬ ВПЕРЕД
Итак, мы установили, что ацетилхолин играет в сетчатке роль нейромедиатора и содержится в небольшой группе амакриновых клеток. Но это был только один нейромедиатор, а нас интересовали и все остальные. Биохимические эксперименты показали, что в сетчатке присутствуют и другие известные кандидаты в нейромедиаторы – например, дофамин, который в головном мозге отвечает за чувство удовлетворения, удовольствия и привязанности. (Нет, это не означает, что сетчатка является частью системы удовольствия – здесь дофамин действует по-другому.) Международная группа ученых во главе с Берндтом Эхингером из Швеции поставила перед собой задачу определить, какие клетки сетчатки содержат другие нейромедиаторы. По мере развития методологий и технологий такие исследования стали намного проще, и я со своей лабораторией присоединился к этим усилиям, хотя и с собственной повесткой.
На мой взгляд, просто составлять список нейромедиаторов сетчатки было скучным делом; гораздо любопытнее было то, что разные нейромедиаторы служили маркерами конкретных типов клеток. В отличие от большинства наших собратьев по цеху, я и горстка других ученых настаивали на том, что нам необходимо знать полные формы различных типов клеток и их реальное количество в сетчатке. Так мы смогли уйти от бессистемного подхода, свойственного классической анатомии. В этом подходе старой школы, который некоторые критики называли коллекционированием бабочек, вы собирали красивые единичные примеры и составляли из них коллекцию – что и становилось вашим исследованием.
Меня же интересовало количество, связи и полные деревья нейронов – разных типов нейронов, которые мы могли идентифицировать благодаря содержанию в них конкретных нейромедиаторов. («Деревом» нейрона (arbor) называется все разветвление его аксонов и дендритов; поскольку эти отростки образуют контакты с другими нейронами, дерево нейрона определяет всю совокупность его возможных связей.) Зная полные структуры и количество разных типов нейронов, мы могли нарисовать нейронную схему сетчатки и таким образом понять, как она функционирует.
