В первом Денк объединил силы с младшим сотрудником Томасом Эйлером, чтобы с помощью двухфотонной микроскопии попытаться разрешить полувековую загадку такого свойства сетчатки, как избирательность в отношении направления. Для этой цели Денк и его коллеги выбрали так называемый звездчатый тип амакриновых клеток. Стимулируя сетчатку движущимся раздражителем, они наблюдали за одной из таких клеток через микроскоп. (Это можно было сделать только с помощью двухфотонного микроскопа, поскольку тот использует свет с такой длиной волны, которая почти не возбуждает палочки и колбочки. Излучение обычного светового микроскопа засвечивало бы фоторецепторы, и те бы не реагировали на тестовый стимул.) Благодаря предварительно введенному в сетчатку индикатору активности исследователи могли видеть, когда звездчатая клетка реагировала на тестовый раздражитель. К своему удивлению, они обнаружили, что те амакриновые клетки, которые синаптируют с избирательными к направлению ганглионарными клетками, сами являются избирательными в отношении направления: если не вдаваться в подробности, именно эти звездчатые клетки заставляют ганглионарные клетки быть чувствительными к направлению.
Одновременно Денк занимался разработкой инновационной технологии – на этот раз не микроскопа, а устройства, позволяющего обойти некоторые сопряженные с использованием микроскопов проблемы. Его изобретение может внести поистине огромный вклад в развитие нейронауки.
Но прежде, чем углубиться в эту область, которая получила название коннектомика, давайте поближе познакомимся с modus operandi Денка. Как я уже сказал, он работает по ночам – хороший способ выкроить несколько часов тишины и покоя. Но что он делает в своем кабинете в два часа ночи? Нет, он не тратит это драгоценное время на стандартную профессорскую рутину вроде подготовки к лекциям, рецензирования рукописей и т. п. Что касается руководства институтом, то он поручает всю трудоемкую или нетворческую работу своим сотрудникам. По ночам он читает и размышляет – то, чем большинство из нас занимается лишь урывками, Денк делает обстоятельно и глубоко.
Еще Денк проводит много времени в самолетах, потому что его приглашают выступать с лекциями по всему миру. Не сказать чтобы ему нравилась работа лектора; он принимает приглашения, потому что они дают ему возможность пообщаться с нужными людьми. Винфрид – гениальный, как сейчас модно говорить, «шмузер», у которого есть свой метод. Он находит людей, изучающих важные для него научные проблемы, и старается вывернуть их ум наизнанку. Я не раз слышал, как, прознав о новом интересном исследовании, он говорил, что поедет пообщаться с его автором, даже если это был совершенно незнакомый ему человек, проживавший где-нибудь на западном побережье США или в Китае.
Поскольку именно я подсказал Денку заняться нейронами сетчатки с избирательностью в отношении направления, он на протяжении нескольких лет удостаивал меня регулярными визитами. Завершив свое исследование и опубликовав большую статью в журнале Nature, он снова явился ко мне и сказал: «Я разгадал твою проблему. Что будем делать дальше?» К сожалению, на тот момент мне нечего было ему предложить – по крайней мере ни одна из имевшихся в моем поле зрения проблем не могла сравниться в важности с проблемой избирательности к направлению. После этого его визиты прекратились. Не примите это за упрек в его адрес! Визиты Винфрида невероятно полезны нам обоим. Я готов с ним «шмузить» – поболтать на научные темы – в любое время.
В год он получает несколько сотен приглашений: если бы он принимал их все, у него бы не осталось времени ни на что другое. Выступления Винфрида притягательны тем, что он к ним почти не готовится. Он бродит по сцене, периодически утыкается взглядом в пол, иногда забывает, каким будет следующий слайд, и, кажется, говорит все, что приходит в голову. Нет, он умеет формулировать свои мысли с кристальной четкостью – и делает это в письменных работах и профессиональном общении. Просто он не желает тратить время на подготовку столь модных сегодня презентаций. Винфриду всегда есть что сказать, но он предпочитает давать слушателям больше свободы. Я уважаю его за это.
Теперь о коннектоме (connectome). Окончание -ome означает «совокупность», в данном случае – это совокупность всех связей. Таким образом, коннектом есть полное описание всей структуры нейрональных связей в нервной системе организма. Составление коннектома человека – процесс, захватывающий дух своей дерзостью, объемом работы и перспективами, и он вряд ли будет завершен при нашей с вами жизни. Но Винфрид изобрел способ, как это можно сделать, а неодолимая сила научного прогресса позаботится обо всем остальном.
Как определить, связаны ли два нейрона? Для этого нужно найти синаптический контакт между ними, что очень непросто, учитывая крошечные размеры синапсов – примерно от 0,5 до 1,0 мкм. При таких размерах приходится использовать электронную микроскопию, и в этом вся загвоздка. Как вы уже знаете, традиционная электронная микроскопия требует разрезания тканевого образца на ультратонкие срезы толщиной примерно 50 нанометров. Это означает, что нужны сотни и даже тысячи последовательных срезов, чтобы охватить всего лишь один синапс, не говоря уже о расстоянии между двумя клетками. Используя традиционные методы, ни один человек не в состоянии нарезать достаточно срезов, чтобы охватить это расстояние, и, даже если это будет сделано, как затем правильно выровнять эти срезы относительно друг друга?
Денк придумал способ решить эти две проблемы одним махом. Разработанный им метод называется сканированием лицевой поверхности блока. В нем так же используется растровая электронная микроскопия, но, в отличие от традиционного подхода, нет необходимости разрезать образец ткани на тысячи тончайших частей: вы сканируете поверхностный слой тканевого блока, после чего срезаете (и выбрасываете) этот слой. В результате перед вами остается новая лицевая поверхность, которую вы снова сканируете электронным микроскопом. Весь процесс резки автоматизирован. Это также решает проблему совмещения изображений: поскольку тканевой блок остается стационарным, при каждом очередном срезе изображение практически не сдвигается.
Таким образом, метод Денка позволяет получить длинный ряд изображений, представляющих серийные срезы тканевого образца с высочайшим разрешением электронной микроскопии. Разумеется, после этого необходимо преодолеть еще множество технических трудностей, но главное, что это дает нам легко выравниваемые изображения, на которых можно проследить нейронные связи – на скромных пока расстояниях, которые, как мы надеемся, значительно увеличатся в будущем. Каждый срез содержит сотни и даже тысячи нейронов, поэтому их прослеживание – колоссально трудоемкая работа (сложная даже для компьютеров). Но в принципе, если мы проделаем эту черновую работу, в конечном итоге мы получим полную карту всех нейрональных связей.
Почему это так важно для нейробиологии? Потому что по большому счету это все, что у нас есть. Мозг – машина связей; если мы будем знать все его связи, мы сможем значительно продвинуться на пути к пониманию того, как работает эта сложнейшая биологическая машина. Винфрид опробовал данный метод на сетчатке глаза и успешно показал, как синаптические связи определяют такое свойство сетчатки, как избирательность к направлению, – причем показал это с такой степенью конкретности и надежности, которая ранее была недостижима при исследовании нейронных сетей.
