Большинство исследователей связывают несвертывание крови с действием биологически активных веществ, выделяемых слюнными железами пиявки и заглатываемых ею вместе с кровью. Как будет показано далее, состав компонентов этих веществ обеспечивает блокирование всех основных механизмов инициирования первичного и вторичного свертывания, а также разрушение сгустков в случае их образования. Кроме того, возможно, в этом процессе принимает участие Aeromonas hydrophila (см. главу о бактериях-симбионтах 2.3). И, наконец, хотя это и не доказано к настоящему времени, возможно, какую-то роль играет и выстилка желудка. В любом случае обращает на себя внимание чрезвычайная длительность сохранения жидкого состояния крови, что совершенно очевидно требует дополнительных исследований. Так, неясно, происходит ли однократное поглощение веществ слюнных желез во время питания или/и в последующем они по мере необходимости выделяются и/или заглатываются животным? Каковы механизмы, стимулирующие бактерии-симбионты на выработку нужных для пиявки веществ в необходимом количестве, в том числе и «пиявочные витамины», и как регулируется этот процесс?
Один раз наевшись, пиявки могут достаточно долго обходиться без пищи. В западной литературе наиболее часто, со ссылкой на различные работы C. M. Lent и данные R. T. Sawyer (1986), указывают срок от 6 до 12 месяцев. С нашей же точки зрения, говоря о периоде голодания пиявки, прежде всего необходимо четко различать два понятия:
• время, которое пиявка сможет прожить после того, как она максимально наелась;
• время, через которое она вновь готова поглощать пищу.
О каком периоде идет речь в работах C. M. Lent, не совсем ясно. Если же говорить о максимальном периоде выживания взрослой половозрелой пиявки массой 5–6 г, то после кормления в условиях искусственного содержания она может обходиться без пищи около 2–2,5 лет. В течение года идет постепенное потребление запасов крови, содержащейся в желудке животного, а в течение следующего периода пиявка живет за счет собственных тканей и в результате может потерять в массе до 80–85 %. При этом она не только худеет, но и уменьшается в длину, как бы проходя обратное развитие, что также представляет определенный интерес для исследований. В естественных условиях, где пиявка вынуждена вести гораздо более активный образ жизни, скорость потребления пищевых запасов идет быстрее. Кроме того, ослабленное животное, скорее всего, станет добычей других хищников.
Несмотря на способность столь долго голодать, медицинская пиявка готова вновь потреблять пищу уже через месяц после кормления, а иногда и раньше, однако при создании условий, максимально приближенных к природным, делает это неохотно и легко отваливается. С каждым месяцем голодания она становится все агрессивнее и активнее при отыскании пищи и нападении, а примерно через 4–5 месяцев достигает так называемой «терапевтической годности», то есть достаточной активности при отыскании пищи, нападении и насасывании крови. Однако отметим, что в это время ее желудок еще содержит остатки крови животного, на котором она питалась последний раз.
При гистологических исследованиях слюнных железистых клеток в этот период голодания в их цитоплазме обнаруживается большое количество содержащих секрет пузырьков (гранул), которые увеличиваются до 1 мкм и полностью заполняют не только тело клетки, но и весь выводной канал (Забкувене Д. В., Синявичене Д. П., 1976), свидетельствуя о максимальной готовности животного к еде (к лечебному применению). При этом в работах американских исследователей показано, что степень заполнения тел клеток гранулами у искусственно выращиваемых животных значительно выше, чем у диких, что безусловно говорит об их более высокой ценности для лечения.
Таким образом, знание основных закономерностей пищевого поведения пиявок в естественных условиях и при искусственном содержании, а также определяющих их механизмов позволяет получить максимальный лечебный эффект от применения медицинских пиявок.
2.5. Биологически активные вещества секрета слюнных желез медицинских пиявок
Как уже указывалось в главе, посвященной истории гирудотерапии (глава 1), в течение многих веков пиявок использовали исключительно в качестве средства для местного кровопускания. И лишь в конце XIX века, в 1884 году, J. B. Haycraft первый получил из пиявки вещество, препятствующее свертыванию крови, названное впоследствии гирудином. Эта работа положила начало научному этапу развития гирудотерапии, но лишь через 70 лет, в 1955 году, F. Markwardt выделил это вещество в чистом виде. До настоящего времени большинство врачей рассматривают пиявку лишь как источник гирудина, действием которого объясняется блокада механизмов свертывания крови. На самом же деле секрет слюнных желез Hirudo medicinalis представляет собой чрезвычайно сложную композицию биологически активных веществ. Сегодня их насчитывается около 20, однако можно с уверенностью сказать, что изучены далеко не все.
Одной из наиболее сложных задач, стоящих перед исследователями, является получение секрета слюнных желез. Ввиду того, что железы не образуют отдельного органа, который можно было бы выделить хирургическим путем, исследования проводились экстрагированием веществ из тканей передней части тела животного, отсекаемого на уровне VII (по J. B. Haycraft) или X (по S. Apathi) сегмента. Полученные вещества в дальнейшем подвергались различным способам очистки.
Лишь в 1985 году российскими учеными И. П. Басковой и Г. И. Никоновым был разработан способ получения слюны, основанный на способности пиявки выделять секрет в ответ на раздражение концентрированным раствором хлористого натрия соответствующих рецепторов области присоски. Второй способ был предложен М. Rigbi и соавторами в 1987 году и состоял в кормлении пиявки имитирующим кровь раствором. Пиявка вместе с раствором заглатывала и выделяемую слюну, а после кормления содержимое желудка выдавливалось и исследовалось. Этот метод чаще всего используется сегодня западными исследователями. Он позволил открыть многие из известных к настоящему времени соединений. Однако понятно, что содержимое желудка или, как его называют в работах западных авторов, «разведенная слюна пиявки» (leech diluted saliva), недостаточно точно отражает реальный состав секрета железистых клеток, поскольку содержит примесь веществ, выделяемых пищеварительными железами пиявки, бактерией-симбионтом или иной флорой.
Совместно с С. С. Сергеевой нами выполнена работа (материал патентуется), позволившая на основе электрофизиологических исследований разработать метод получения достаточного количества чистого секрета, лишенного каких-либо посторонних примесей. Животное при этом минимально травмируется и впоследствии способно к спариванию и размножению.
Полученный секрет оказался, как уже было указано, достаточно сложным комплексом, на 85–90 % состоящим из воды. В сухом остатке можно выделить три больших группы веществ:
• белки и пептиды;
• липиды;
• полисахариды.
И около 8 % соединений сухого остатка нами не идентифицировано.
Мы провели анализ динамики выделения гликопротеидов, полисахаридов, гирудина, бделлинов, дестабилазы и гиалуронидазы в секрете, полученном по методу М. Rigbi и соавторов в модификации И. П. Басковой (Баскова И. П. и др., 2001). Полученные результаты подтверждают данные И. П. Басковой и соавторов о том, что в процессе питания животное выделяет секрет различного состава. Мы считаем, что выделение на разных стадиях питания животного слюны различного состава функционально обосновано и обеспечивает решение различных задач. Сначала – разрушение тканей и микрососудов жертвы, затем – блокаду механизмов гемостаза, а на последнем этапе – противодействие защитным реакциям, развивающимся в тканях в ответ на повреждение. Полученные результаты дают достаточно серьезные основания считать, что железистые клетки неоднородны и вырабатывают секрет различного состава. Учитывая вышесказанное, нам представляется целесообразным объединить известные к настоящему времени биологически активные соединения медицинских пиявок в четыре группы.
