22 июня 1941 года «Лембит» находилась в составе 3 дивизиона 1 Бригады подводных лодок в Либаве. 23 июня подводная лодка прибыла в Виндаву, 25 июня – перешла в Усть-Двинск, 27 июня – в Кувайсте, 1 июля – в Пальдиски. 5 июля «Лембит» прибыла в Кронштадт, где до конца месяца проходила ДОКование.
3 августа 1941 года подводная лодка перешла в Таллинн и 10 августа вышла на свою первую минную постановку в район мыса Аркона. 15 августа «Лембит» попала в сильный шторм, из-за чего вышла из строя гидравлическая система: одновременно вышли из строя системы управления вертикальными и горизонтальными рулями, подъема перископов, минного устройства и открытия люка корабельного орудия. За три часа, пока подводная лодка продолжала движение, удерживаясь на курсе электромоторами, три члена экипажа привели подводную лодку в боеспособное состояние. 17 августа в 13–15 милях севернее мыса Аркона «Лембит» выставила минное заграждение из 20 мин, после чего начала возвращение на базу. Встреченная эскортом, подводная лодка вечером 21 августа прибыла в Таллинн.
28 августа 1941 года в составе Отряда Главных Сил Балтийского флота «Лембит» совершила таллиннский прорыв, и на следующий день подводная лодка прибыла в Кронштадт. В ночь на 5 ноября подводная лодка вышла к южному входу в Бьеркезунд для постановки мин в этом районе. Утром 5 ноября подводная лодка установила 5 банок по 4 мины. Вечером 5 ноября «Лембит» ошвартовалась в Кронштадте.
В ночь на 13-е августа 1942 года подводная лодка перешла в Кронштадт, по пути была обстреляна артиллерией противника. Утром 18 августа подводная лодка прибыла к Лавенсари, откуда в составе второго эшелона подводных лодок КБФ, в сопровождении тральщиков вышла для действий в район острова Утё. В ночь на 25 августа подводная лодка произвела разведку рейда Утё. На обратном пути в тринадцати кабельтовых от берега подводная лодка выскочила на банку, была вынуждена всплыть, и была замечена береговым постом наблюдения противника. 28 августа подводная лодка перешла в район маяк Богшер – маяк Чекарстен, где 4 сентября произвела безрезультатный торпедный залп из двух торпед по транспорту из состава конвоя. 9 сентября у острова Богшер «Лембит» вновь пыталась атаковать германский конвой, но при выходе в атаку, из-за угрозы тарана одного из сторожевых кораблей, подводная лодка была вынуждена погрузиться. Вечером 13 сентября у острова Утё подводная лодка выпустила две торпеды по немецкому конвою, но в цель не попала. Днем 14 сентября «Лембит» обнаружила конвой противника, и двумя торпедами потопила транспорт «Финланд».
В ночь на 15 сентября 1942 года подводная лодка отошла к мысу Ристна и через сутки начала форсирование Финского залива. С наступлением темноты вечером 17 сентября на
Западном Гогландском плесе подводная лодка всплыла для зарядки батареи, но зарядку пришлось прекратить, так как подводную лодку обстрелял из автоматической пушки сторожевой катер противника. 18 сентября на «Лембит» сбросили глубинные бомбы финские сторожевые катера VMV-2 и VMV-13. Днем «Лембит» прибыла на Лавенсари, а утром 22 сентября в Кронштадт. 5 октября 1942 года «Лембит» перешла в Ленинград для ремонта и зимней стоянки. В августе – ноябре 1943 года «Лембит» прошла ДОКование и средний ремонт.
С наступлением весны 1944 года подводная лодка перешла в Кронштадт. В сентябре 1944 года Финляндия вышла из войны, корабли Балтийского флота имели возможность финскими шхерными фарватерами выходить в открытую часть Балтики, финны предоставили советской стороне свои порты и ремонтную базу. 5 октября 1944 года «Лембит» завершила переход в Балтийское море. При первом же погружении обнаружилась необходимость в дифферентовке и подводной лодке пришлось вернуться к Утё. Вечером 7 октября подводная лодка продолжила поход и в ночь на 11 октября произвела минную постановку. Вечером 12 октября 1944 года «Лембит» обнаружила легкий крейсер «Нюрнберг», но атака не состоялась из-за большой скорости и частого изменения курса цели. Ночью 13 октября в 45 милях южнее острова Эланд «Лембит» двумя торпедами атаковала одиночное судно. Транспорт сумел уклониться, и подводной лодке пришлось потратить еще две торпеды для поражения цели.
В ночь на 16 октября 1944 года в виду израсходования запасов топлива «Лембит» начала возвращение на базу и к вечеру 18 октября прибыла в Хельсинки. Так как соглашение о ремонте советских кораблей в Финляндии не было до конца урегулировано, подводной лодке для ремонта пришлось идти в Кронштадт, где она с 30 октября по 14 ноября прошла ДОКование. 27 ноября подводная лодка прибыла на Ханко. 3 декабря подводная лодка произвела минную постановку в 3-х милях северо-западнее маяка Брюстерорт.
Утром 11 декабря 1944 года «Лембит» произвела торпедную атаку по конвою. Через 35 секунд после пуска торпед на подводной лодке был услышан взрыв большой силы – на подводной лодке были повреждены легкий корпус и ограждение рубки, а вскоре обнаружилось сильное поступление воды в прочный корпус. Вечером того же дня подводная лодка начала возвращение на базу. Днем 14 декабря западнее острова следуя в подводном положении «Лембит» ударилась о подводный предмет. Подводную лодку подбросило на четыре метра, затем она сползла с неизвестного объекта. Немедленно всплыв, подводная лодка обнаружила на поверхности воды пятно соляра и деревянный решетчатый люк и его обломки. У самой подводной лодки повреждения ограничились вмятиной на крышке торпедного аппарата правого борта. Вероятнее всего, идя в подводном положении, «Лембит» столкнулась с корпусом затонувшего судна. 15 декабря подводная лодка прибыла в Турку, откуда на следующий день перешла в Хельсинки, где прошла ДОКовый ремонт.
6 марта 1945 года Указом Президиума Верховного Совета СССР подводная лодка «Лембит» награждена Орденом Красного Знамени.
В следующий боевой поход «Лембит» вышла 23 марта 1945 года.
Днем 30 марта «Лембит» выставила минное заграждение в 10 милях северо-восточнее маяка Риксгафт. В районе банки Северная Средняя подводная лодка легла на грунт для устранения неисправностей.
Днем 7 апреля «Лембит» подверглась безуспешной атаке германской подводной лодки, а 9 апреля в районе маяка Хоборг была обнаружена противолодочными кораблями и полтора часа преследовалась ими (на подводную лодку было сброшено 85 глубинных бомб). 10 апреля преследования возобновились. В этот момент на подводной лодке вышел из строя коллектор левого дизеля и компрессор воздуха высокого давления №-2. В ночь на 11 апреля в виду аварийного состояния подводной лодки было принято решение возвращаться на базу. Утром 13 апреля в районе острова Нюхамн подводная лодка была встречена ледоколом и утром следующего дня прибыла в Турку, где встала на ремонт где встретила известие об окончании войны.
17 января 1946 года «Лембит» была выведена из Боевого состава флота и переформирована в учебную подводную лодку. Подводная лодка была передана Краснознаменному Учебному отряду подводного плавания им. Кирова и 18 июня 1946 года получила обозначение «У-1», а с 12 января 1949 года – «С-85».
