В 1559 году Поссевино вступает в орден иезуитов, причем проходит новициат, то есть двухлетний срок испытания, за 6 месяцев. Почти сразу же ему даются ответственные поручения. Генерал ордена Лайнес посылает его в Савойю, где в это время заметно усилилось реформационное движение (1560). Объехав Пьемонт и Савойю, Поссевино доложил о положении дел герцогу Эммануилу Филиберту и настоял на применении самых жестоких мер к еретикам. Против протестантов было послано двухтысячное войско, которое сопровождал сам иезуит.
К 1565 году относится процесс во французском парламенте о праве иезуитов преподавать в Парижском университете. Поссевино добился того, что иезуиты «пока» были оставлены в качестве преподавателей университета. По поручению папского двора он основал ряд иезуитских коллегий, в частности коллегию в Авиньоне, и сам стал ее ректором.
В 1569 году, когда Поссевино отправился в Рим, чтобы принять последний, четвертый, обет ордена и вступить в высший класс Общества Иисуса, в Авиньоне распространился слух, что Поссевино имеет секретное поручение ходатайствовать о восстановлении здесь инквизиции. В городе началось волнение, папскому легату кардиналу д’Арманьяку с трудом удалось успокоить авиньонцев.
В 1572–1578 годах Поссевино был секретарем генерала ордена. Папа Григорий XIII, пристально следивший за событиями на севере, в 1577 году отправил Поссевино в Швецию для обращения короля Юхана III в католичество.
Юхан III понимал, что восстановить католицизм в Швеции невозможно без предварительных уступок со стороны папы по нескольким вопросам церковной обрядности. Он передал Поссевино список из 12 пунктов, по которым находил необходимым «исходатайствовать диспенсацию» со стороны Рима для шведской церкви.
В 1578 году Поссевино вернулся в Рим, чтобы добиться скорейшего ответа на требования шведского короля. Папская комиссия нашла возможным удовлетворить пять важнейших пунктов. Поссевино был отправлен обратно к Юхану III, будучи назначенным его папским нунцием в Швеции и апостольским викарием для Руси, Ливонии, Венгрии, Померании и Саксонии. Ему также было поручено разузнать о положении дел в Московии.
По дороге в Швецию Поссевино остановился в Вильно, где встретился с польским королем Стефаном Баторием.
Поссевино посетил также баварского герцога Альбрехта, императора Рудольфа II и позаботился об устройстве для шведов отделений при католических коллегиях в Ольмюце и Браунсберге.
В 1579 году иезуит прибыл в Швецию. Но Юхан III отказался от плана воссоединения шведской церкви с католической. Несмотря на все старания Поссевино король своего решения не изменил, и иезуит вернулся в Рим (1580).
В Риме Поссевино принял русское посольство Шевригина (24 февраля 1581 года). Посольство Иоанна Грозного прибыло к Григорию XIII с просьбой выступить посредником между Москвой и Стефаном Баторием.
Папская курия направила Поссевино в Московию, преследуя свою цель – в ходе переговоров привлечь Ивана IV к антиосманской лиге и таким образом приблизить его к папскому двору, затем постепенно обратить русского царя в католичество и подготовить почву для полного окатоличивания России.
27 марта 1581 года вместе с русскими послами Поссевино выехал из Рима. Остановившись в Венеции, иезуит вел переговоры о вовлечении Венецианской республики в антитурецкую лигу и о возможных торговых отношениях Венеции с Россией. В Австрии, Богемии, Речи Посполитой Поссевино вошел в положение дел и регулярно отсылал донесения в Рим. В Граце (Штирия) дипломат встречался с Кобенцелем, побывавшим в России в качестве посла императора Максимилиана, и имел с ним продолжительную беседу о положении дел в России.
13 июня Поссевино прибыл в Вильно к польскому королю. Баторий сначала без энтузиазма принял посредничество иезуита, считая, что переговоры дадут передышку «московиту» и позволят ему стянуть новые силы в западные области. Но Поссевино увлек Батория картиной той исторической роли, которую ему будет суждено сыграть: заключив мир с Иваном IV, Баторий подготовит почву для объединения восточной и западной церкви и будет содействовать распространению католичества в северных и восточных областях. Этим же он обеспечит себе поддержку папского престола.
3 июля Поссевино вместе с канцлером Яном Замойским прибыл в Дисну. Поссевино добился у короля разрешения конфисковать в пользу иезуитской коллегии, основанной в Вильно в 1579 году, часть имений, принадлежавших ранее русской церкви.
18 августа Поссевино приехал в Старицу, где в это время находился Иван IV. Посланник вручил царю письма папы и императора Рудольфа, а также подарки и письма к царице и царевичам. Иезуит узнал условия Ивана IV: царь отдает Полоцк с пригородами, Луки, Заволочье, себе же требует 36 замков в Ливонии, в их числе Нарву с пригородами. Поссевино при этом были показаны некоторые документы из архивов, подтверждавшие права русских на Ливонию. Папский дипломат пробыл в Старице около месяца. Иван Грозный несколько раз принимал его, и каждый раз Поссевино пытался начать разговор с ним о вере и объединении церквей, от чего царь упорно уклонялся.
14 сентября Поссевино отправился из Старицы в польский лагерь под Псковом, куда прибыл 5 октября. Положение поляков к этому времени резко ухудшилось. Стойкая оборона защитников Пскова, отсутствие средств на продолжение длительной осады и внутренние раздоры в польском лагере вызывали недовольство у самих осаждающих. Тем не менее требования Ивана Грозного показались Баторию чрезмерными, и он не захотел вести переговоры на таких условиях.
Поссевино тотчас отправил царю очень красноречивое письмо, в котором положение русских нарисовал самыми мрачными красками. Поссевино писал также, что шведский король взял Ивангород и Нарву и, следовательно, может вторгнуться в пределы Московии. Уступка Ливонии, убеждал иезуит, не будет особенно тяжелой для русской стороны, так как он обещает испросить у польского короля право свободного проезда через ливонские земли для послов и купцов.
Вероятно, под влиянием этого письма в наказе своим послам, Дмитрию Елецкому «со товарыщи», русский царь выдвинул более умеренные и невыгодные для русских требования: он соглашался передать польской стороне всю Ливонию, оставив за собой Великие Луки, Невель, Заволочье, Холм и псковские пригороды. Послам также было предписано не поднимать вопроса о Нарве.
Поссевино вместе с польскими послами выехал из псковского лагеря в Ям Запольский, где была назначена встреча послов. Переговоры начались 13 декабря в деревне Киверова Горка в нескольких километрах от Яма Запольского (между Заволочьем и Порховом) и продолжались больше месяца (до 15 января 1582 года). Поссевино проявлял при этом большую активность: вел все заседания, писал протоколы, обменивался письмами с русским царем, польским королем, канцлером Замойским, кардиналом ди Комо, шведским королем и другими, снимал копии со всех документов. Переговоры шли медленно. Несколько раз польские послы в раздражении на неуступчивость русских уходили с заседаний, заявляя, что больше не вернутся. Поссевино старался примирить враждующие стороны и ускорить ход переговоров. Полякам советовал прекратить осаду Пскова, так как это затрудняло перемирие. Говорил о стойкости русских при защите своих крепостей, приводя в пример безуспешную осаду Печерского монастыря войсками Батория. В то же время в письмах к Ивану Грозному он писал о бедственном положении русских.
