Как потом выяснилось, группа Кунина была права не только насчет функции CRISPR-кассет, но и насчет механизма работы бактериального иммунитета. Они предположили, что этот механизм похож на РНК-интерференцию эукариот. Напомню, что при РНК-интерференции короткие фрагменты чужеродной РНК используются особыми клеточными белками для поиска длинных чужеродных молекул РНК и их уничтожения. Аналогично CRISPR-система бактерий использует короткие фрагменты «направляющих РНК», синтезированных со спейсеров, для обнаружения полноразмерных молекул ДНК бактериофагов.
Бактерии производят длинные молекулы РНК, содержащие последовательности всех спейсеров. Эти молекулы разрезаются на короткие фрагменты, каждый из которых соответствует ровно одному спейсеру. Полученные направляющие РНК помогают комплексу белков находить любые генетические последовательности, комплементарные спейсеру, например ДНК вирусов. Обнаруженные фрагменты после опознания разрезаются. Подобно антивирусным программам, бактерии регулярно пополняют свою «базу данных» спейсеров, когда сталкиваются с новыми бактериофагами (если переживают эту встречу).
Подтверждение роли CRISPR-системы в бактериальном иммунитете было опубликовано в 2007 году в журнале Science и принадлежит группе ученых из компании Damsco
[315]. Исследователи хотели улучшить йогурт, защитив молочнокислые бактерии от бактериофагов, но волей случая внесли вклад в открытие одного из самых важных методов редактирования ДНК живых организмов.
В 2012 году в журнале Science вышла статья ученых из Медицинского института Говарда Хьюза, в которой было показано, что один из белков бактериальной CRISPR-системы (белок Casp) умеет разрезать молекулы ДНК в строго определенных местах
[316]. Для этого достаточно предоставить ему специально подобранные направляющие РНК. Год спустя все та же группа исследователей опубликовала статью под названием «РНК-программируемое редактирование генома клеток человека»
[317]. Оказалось, что белок Casp может работать и в клетках человека, если вместе с геном белка Casp внедрить в них ген, кодирующий направляющую РНК к какой-нибудь последовательности человеческой ДНК. Параллельно другая группа исследователей генетически модифицировала мышей с помощью Casp
[318]. Но самое интересное было дальше.
Рассмотрим организм, у которого на одной из хромосом возникла новая мутация. Каждому потомку организма передается только одна родительская хромосома из пары, поэтому, если скрестить организм с мутацией (на одной хромосоме) и организм без мутации, половина их потомков унаследует генетическое изменение, а половина не унаследует. Если скрестить полученных потомков, несущих мутацию, друг с другом, четверть особей следующего поколения будет иметь мутацию на обеих хромосомах, половина на одной, а четверть окажется вовсе без мутации. Несложно заметить, что это классическое наследование (по Менделю) не очень эффективно в передаче нового «мутантного» варианта потомкам.
В 2015 году в журнале Science вышла статья с описанием «мутагенной цепной реакции». МЦР — это новый метод быстрого редактирования геномов живых организмов на основе белка Casy
[319]. Он позволяет не только внести какую-то последовательность ДНК в определенное место генома, но и обойти вышеупомянутые законы наследования и добиться того, чтобы в результате скрещивания генетически модифицированного и обычного организма получались только генетически модифицированные потомки, причем с мутацией сразу на обеих копиях хромосомы. Как это сделать?
Мы выбираем место, которое хотим редактировать, и ген, который хотим вставить. Создаем плазмиду, содержащую целевой ген, ген белка Casy и ген специально подобранной направляющей РНК, распознающей желаемое место вставки. Все это обрамляется двумя последовательностями ДНК, комплементарными участкам хромосомы предшествующему и следующему за местом разреза (будущим местом вставки). Плазмида с такой конструкцией переносится в клетку. Внутри клетки синтезируется белок Casy, который связывает направляющую РНК и делает двухцепочечный разрез в комплементарном ей участке одной из хромосом. Клетки не любят разрезы в ДНК (а точнее, «оголенные» концы этих молекул) и пытаются их исправить, снова сшить молекулы.
Иногда для исправления разреза подключается особый клеточный механизм починки ДНК, который в поисках информации о том, как выглядела молекула ДНК до разреза, может обратиться ко второй копии хромосомы. Используя эту информацию, механизм, названный гомологичной рекомбинацией, может проверить, не пропало ли что-нибудь в месте разреза, и восстановить недостающие нуклеотиды.
Если клетка использует для починки вторую копию хромосомы или просто сошьет концы вместе, ничего не изменится. Белок Casy снова сделает разрез, и клетке придется чинить ДНК заново.
С другой стороны, на копию хромосомы очень похожа наша плазмида, так как у нее есть обрамляющие участки, точно совпадающие с участками вокруг разреза! Из-за этих участков система починки ДНК может перепутать плазмиду со второй копией хромосомы и синтезировать копию нашей конструкции (с целевым геном, геном Casy и геном направляющей РНК) в место разреза. Когда вторая копия хромосомы будет разрезана все тем же белком Casy, «дырка» в ДНК исправится за счет копирования участка с первой (уже генетически модифицированной) копии хромосомы или участка с нашей плазмиды. В любом случае обе хромосомы окажутся с нужной нам вставкой.
Когда наша генетически модифицированная хромосома передастся потомку организма, в его клетках тоже будут синтезированы белок Casy и направляющая РНК. В результате вторая копия хромосомы, доставшаяся от другого родителя, тоже будет изменена. Получается, что генетически модифицированная хромосома превращает немодифицированные копии хромосомы в себе подобные, а вставка очень эффективно распространяется в популяции. Если организм с такой вставкой выпустить в окружающую среду, шансы, что вставка распространится, будут очень высоки. А значит, такой подход теоретически можно использовать для инженерии природных популяций — например, для борьбы с разносчиками инфекций.
