Иной раз в приступе сентиментальности я ощущал любовь ко всем присутствующим и к каждому персонально. Из-за этого безрезультатность наших попыток казалась еще горше.
На пятничных собраниях весной 2007 года наша сплоченная группа показала себя с наилучшей стороны. Люди вбрасывали идею за идеей, одна безумнее другой, как увеличить долю неандертальской ДНК или найти “карманы” с наибольшим ее содержанием. Невозможно сказать, чья идея в конце концов сыграла, потому что мысли рождались на глазах, по ходу живейшего обсуждения, где все говорили и все принимали участие. Мы стали обсуждать, нельзя ли как-то отделить бактериальную ДНК от всего остального. Может, у бактериальной ДНК есть какое-то свойство, на которое можно нацелиться и оно сработает: ну, к примеру, размер бактериальных и неандертальских фрагментов. Но нет и нет – размер бактериальных фрагментов был таким же, как и неандертальских.
Но все же, все же чем отличаются бактериальные последовательности от ДНК млекопитающих? – спрашивали мы себя. И вот наконец меня осенило – метилирование! Метильные группы присоединяются к нуклеотидам, чуть-чуть химически изменяя их, но не саму последовательность. У бактериальной ДНК чаще метилируются аденины, а у млекопитающих метилируются в основном цитозины. Возможно, стоит попробовать подобрать антитела к метилированным аденинам и, таким образом, выделить бактериальную ДНК из экстрактов. Антитела – это белки, которые производятся иммунной системой, когда та узнает о внедрении чужеродной субстанции, например бактериальной или вирусной ДНК. Они циркулируют в крови, едва только обнаружат поблизости чужеродных агентов, накрепко связываются с ними и так помогают от них избавиться. Так как антитела строго специфичны, то есть связываются только с теми веществами, которые были предъявлены иммунным клеткам, они стали мощным инструментом в лабораторных работах. Например, если впрыснуть мыши метилированный аденин, то ее иммунные клетки распознают этот метилированный аденин как чужеродного оккупанта и произведут специфические антитела к метилированному аденину. Эти антитела можно потом выделить из крови мыши, очистить и использовать в лабораторных экспериментах. Я подумал, что мы можем изготовить такие антитела и попробовать с их помощью убрать бактериальную ДНК из вытяжек.
Быстрый поиск по литературе показал, что неподалеку от Бостона есть такая компания New England Biolabs, где исследователи уже синтезировали антитела к метилированным аденинам. Я написал Тому Эвансу, прекрасному ученому, который занимался репарацией ДНК и работал, как я знал, в этой компании. И он любезно прислал нам антитела. Теперь требовался доброволец из группы, который с их помощью попробовал бы связать бактериальную ДНК и удалить ее из вытяжки. Я надеялся, что таким образом мы сможем существенно повысить долю неандертальской ДНК. Задумка казалась мне весьма остроумной. Но когда я на собрании изложил ее нашей группе, она была встречена с изрядным скептицизмом. Я подумал, что дело опять-таки в неприятии незнакомых методик. Но теперь я припомнил им опыты с радиоактивностью. И таки настоял на своем. Эдриан Бриггс взялся за дело. Много месяцев он провел, пытаясь заставить антитела связываться с бактериальными фрагментами и отделить их от небактериальных. Он испробовал все мыслимые вариации методик. Так ничего и не сработало. Мы не понимали почему – и до сих пор не понимаем. Я уже стал привыкать к ехидным шуточкам по поводу гениальности своей идеи с антителами.
Но чем же еще эту бактериальную ДНК изничтожить, как от нее избавиться? Высказывалось предложение найти какой-нибудь часто повторяющийся мотив в бактериальных последовательностях. Тогда мы бы смогли с помощью синтетической ДНК связать эти мотивы и убрать бактериальную ДНК, примерно так, как мы пытались это проделать с антителами. Наш тихоня Кай Прюфер, студент-компьютерщик, который после появления в лаборатории самостоятельно выучил и стал понимать биологию генома лучше, чем любой студент-биолог, вызвался поискать такие потенциально полезные мотивы. И нашел. У него определилось несколько таких комбинаций из двух – шести нуклеотидов, которые гораздо чаще встречались у бактерий, чем в неандертальской ДНК, например, ЦГЦГ, или ЦЦГГ, или ЦЦЦГГГ и т. д. И когда он доложил об этом на собрании, то все вдруг стало на свои места. Конечно, как я об этом раньше не подумал! В каждом учебнике по молекулярной биологии так и написано: в геноме млекопитающих сравнительно редки такие сочетания нуклеотидов, где Ц идет за Г. А причина этого проста – у млекопитающих метилируются только те цитозины, за которыми стоят гуанины. Такие метилированные цитозины прочитываются ДНК-полимеразой с ошибками и в этом случае превращаются – мутируют – в тимины. В результате в течение миллионов лет эволюции в геноме млекопитающих постепенно становилось все меньше и меньше ЦГ-сочетаний. У бактерий, напротив, цитозины не метилируются, или это происходит редко, и поэтому ЦГ-мотивы у них обычны.
Можем ли мы как-то использовать это свойство? Ответ для нас всех был, естественно, очевиден. У бактерий имеются ферменты, так называемые рестриктазы, которые разрезают ДНК в местах с конкретными и специфичными мотивами, такими как ЦГЦГ или ЦЦЦГГГ. Если мы выдержим нашу неандертальскую вытяжку с набором таких ферментов, то они порежут бактериальную ДНК на мельчайшие кусочки, которые уже нельзя секвенировать, а неандертальская ДНК останется целехонька. И тогда та чуточка неандертальской ДНК увеличится относительно бактериальной, а нам того и нужно. На основе своего анализа Кай предложил коктейль из восьми рестриктаз, чтобы уж точно сработало. Мы немедленно обработали им одну из наших вытяжек этой смесью и отсеквенировали ее. Секвенатор выдал результат: 20 процентов неандертальской ДНК против обычных четырех процентов! А это значило, что теперь нужны не несколько тысяч циклов секвенирования, а только семь сотен. Для группы в Брэнфорде этот объем работы выглядел в пределах достижимого. Вот она, эта маленькая хитрость, сделавшая невозможное возможным. Единственный изъян методики виделся в том, что потеряются те участки, которые все же содержат мотивы ЦГ. Но их мы сможем выловить, используя различные наборы рестриктаз и сравнивая с результатами секвенирования без ферментов вообще. И вот мы представили наши наработки с рестриктазами Майклу Эгхольму в 454. “Блестяще!” – сказал он. Впервые мы почувствовали, что достижение нашей цели вообще реально.
А пока суд да дело, появляется статья молодого талантливого генетика Джеффри Уолла из Сан-Франциско, с которым мне несколько раз доводилось встречаться. Он сравнил 750 тысяч нуклеотидов из Vi-33.16, полученных нами по методу 454 и представленных в Nature, с 36 тысячами нуклеотидов, прочтенных группой Эдди Рубина по методу бактериального клонирования из наших экстрактов той же кости и опубликованных в Science. Уолл вместе с соавтором по имени Сун Ким указали на ряд различий, многие из которых мы уже обсудили при подготовке статей к печати. Они предположили, что дело может быть в недоработках методик 454, но, скорее всего, нужно винить современные загрязнения в наших библиотеках. По их расчетам, 70–80 процентов ДНК, которую мы считали неандертальской, нужно отнести к современной человеческой[55].
Расчеты настораживали. Мы знали, что загрязнения могут замешаться и в набор данных, опубликованный в Nature, и в библиотеки из Science, мы ведь отсылали экстракты в лаборатории, где не было необходимых стерильных условий нашей “чистой комнаты”. Также мы знали, что уровень загрязнений наверняка больше в данных по 454, если уж говорить о разнице в уровнях загрязнения двух наборов данных. Но при этом понимали, что в любом случае уровень загрязнений не может быть 70–80 процентов, потому что в основе расчетов Уолла лежало предположение о равном количестве Г и Ц в коротких и длинных фрагментах, а мы уже знали, что это предположение неверно.
