Теорию Митчелла игнорировали, принимали в штыки, считали сумасшедшей или объявляли неоригинальной. Рэкер позже писал: «На фоне тогдашних умонастроений научного сообщества эти формулировки звучали как высказывания придворного шута или безумного пророка». Митчелл излагал свои мысли на странном, почти мистическом языке электрохимиков и опирался на концепции, о которых энзимологи того времени не имели почти никакого представления. Всерьез, хоть и скептически, их поначалу приняли только Рэкер и Билл Слэйтер из Амстердама (еще один ученик Кейлина), но Слэйтер скоро потерял терпение.
Сам Митчелл только усугублял ситуацию. Блестящий оратор и неутомимый спорщик, он мог ни с того ни с сего раздраженно оборвать собеседника или пуститься в велеречивые разъяснения. Его манера вести дискуссию доводила оппонентов до белого каления. Однажды в споре с Митчеллом Слэйтер, вне себя от ярости, запрыгал на одной ноге. Столкновения не прошли бесследно и для Митчелла, который заработал себе язву желудка и был вынужден уйти из Эдинбургского университета. На два года он совсем отошел от науки и занялся восстановлением заброшенной усадьбы Глинн-хаус около Бодмина в графстве Корнуолл, превратив ее в свою семейную резиденцию и частный исследовательский институт. Он вернулся на научный фронт в 1965 г., препоясав чресла к предстоящим битвам. И они не заставили себя ждать. Споры, бушевавшие следующие два десятилетия, получили название «окисфоссных» войн (от окислительного фосфорилирования — механизма образования АТФ при дыхании).
Объяснительная сила протон-движущей силы
Гипотеза Митчелла объясняла абсолютно все затруднения прежних теорий. Стало понятно, зачем нужна мембрана и почему она должна быть целой и невредимой. Через поврежденную мембрану протоны протекали бы обратно, и протон-движущая сила рассеивалась бы в виде тепла. От дырявой плотины толку нет.
Объясняла она и действие загадочных разобщителей. Вспомним, что разобщение — это утрата связи между окислением глюкозы и производством АТФ (ситуация, когда слетела цепь и велосипед не едет, сколько ни жми на педали). Прежде казалось, что единственная общая черта разобщающих агентов — это рассоединение «входа» и «выхода» энергии. Митчелл показал, что у них есть и общее химическое свойство: все разобщители — это слабые кислоты, растворяющие липиды мембраны. Поскольку слабые кислоты могут связывать, а могут и высвобождать протоны в зависимости от кислотности окружающей среды, они могут переносить протоны через мембрану. В щелочных или слабокислых условиях они теряют протон, получают отрицательный заряд и, притягиваемые электрическим зарядом, переходят на положительную («кислую») сторону мембраны. Затем, как и полагается слабым кислотам в сильнокислых условиях, они снова «подбирают» протон. Это нейтрализует электрический заряд, и слабые кислоты снова подпадают под влияние градиента концентрации. Они переходят на менее кислую сторону мембраны, теряют протон и попадают под действие электрического притяжения. Такой цикл возможен, только если разобщитель растворяется в мембране независимо от того, связал он протон или нет, и именно этот тонкий момент и сбивал с толку исследователей. (Некоторые слабые кислоты растворимы в липидах, но только после присоединения (или потери) протона; потеряв (или присоединив) протон, они перестают быть жирорастворимыми, а значит, не могут снова пересечь мембрану. Поэтому такие слабые кислоты не разобщают дыхание.)
Хемиосмотическая гипотеза объясняла также одну, даже более важную проблему — достойное магии вуду «действие на расстоянии», для которого, казалось, совершенно необходим макроэргический посредник, та самая неуловимая тильда. Протоны, закачанные через мембрану в одном месте, создают силу, которая действует одинаково на всей поверхности мембраны, — так, давление воды на плотину зависит от общего объема воды, а не от местонахождения насоса. Таким образом, протоны закачиваются через мембрану в одном месте, но могут возвращаться через АТФазу в любом другом месте мембраны с силой, которая зависит от общего давления протонов. Иными словами, химического посредника нет. Посредником служит сама протон-движущая сила. Заодно стало понятно, как в производство АТФ может быть вовлечено нецелое число электронов. На каждый перенесенный электрон через мембрану действительно закачивается фиксированное число протонов, но некоторые из них просачиваются обратно через мембрану, а другие расходуются не на работу АТФазы, а на другие цели (подробнее об этом в следующем разделе).
Кроме того, — и это, возможно, главное, — хемиосмотическая теория позволяла сформулировать целый ряд четких предсказаний, которые можно было проверить. На протяжении следующего десятилетия Митчелл, обосновавшийся в обновленном Глинн-хаусе вместе со своей верной соратницей Дженнифер Мойл и другими исследователями, доказал, что по обеим сторонам внутренней мембраны митохондрий действительно возникает и градиент pH, и разность потенциалов (около 150 мВ). Может показаться, что это мало (всего лишь десятая часть напряжения батарейки карманного фонарика), но посмотрите на это в молекулярном контексте. Толщина мембраны — не более 5 нм (10-9 м), поэтому напряжение между ее сторонами составляет примерно 30 миллионов вольт на метр, что равносильно удару молнии и в тысячи раз больше мощности домашней электропроводки. Митчелл и Мойл также показали, что внезапное повышение концентрации кислорода вызывает кратковременное повышение числа закачиваемых через мембрану протонов; они показали, что дыхательные «разобщители» действительно переносят протоны туда-сюда через мембрану, как челноки; а еще они показали, что АТФаза действительно приводится в действие протон-движущей силой. Они продемонстрировали, что закачивание протонов сопряжено с транспортировкой электронов по дыхательной цепи и что оно замедляется или даже останавливается, если заканчивается «сырье» (атомы водорода, кислород, АДФ или фосфат).
К этому времени Митчелл и Мойл были уже не единственными экспериментаторами в хемиосмотической области. Рэкер помог склонить сомневающихся на сторону хемиосмоса, показав, что изолированные дыхательные комплексы, добавленные к искусственным липидным пузырькам, сохраняют способность создавать протонный градиент. Однако наибольшее значение для убеждения ученых, по крайней мере ботаников, в справедливости теории Митчелла имел один конкретный эксперимент, который поставили Андрэ Ягендорф и Эрнест Юрайб из Корнелльского университета. Поначалу, кстати, Ягендорф принял хемиосмотическую гипотезу в штыки. Он писал: «Слушал, как Питер Митчелл рассказывал о хемиосмосе на встрече биоэнергетиков в Швеции. Его слова влетели мне в одно ухо и вылетели через другое; все, что осталось — это досада на организаторов, пригласивших такого смехотворного и малопонятного докладчика».
Однако в 1966 г. Ягендорф и Юрайб поместили мембраны хлоропластов в кислоту при pH = 4 и подождали, пока концентрация кислоты по обе стороны мембраны уравновесится. Затем они ввели в препарат щелочь (pH = 8), так что разница кислотности по разные стороны мембраны составила 4 единицы pH. Результатом оказалось образование большого количества АТФ. При этом ни света, ни какого-либо другого источника энергии не было; синтез АТФ происходил за счет одной только разницы в концентрации протонов. Обратите внимание, что Ягендорф и Юрайб работали с фотосинтетическими мембранами. Поразительная особенность теории Митчелла заключалась в том, что она подводила общую базу под разные и, казалось бы, не связанные между собой способы производства энергии, а именно фотосинтез и дыхание. В обоих случаях синтез АТФ происходит за счет протон-движущей силы.
