Поразительно, какие плоды приносит здоровая конкуренция при условии щедрого финансирования! Вскоре после завершения проекта «Геном человека» Национальный институт здравоохранения США объявил новый конкурс грантов под названием «Геном за $1000». Честно говоря, это звучало как насмешка: удешевить секвенирование в три миллиона раз! Это вы серьезно? Хотите верьте, хотите нет, но спустя 15 лет конкурс был остановлен, так как он выполнил свою задачу. За прошедшие годы какие только подходы ни напридумывали! Большинство идей не выдержало конкуренции, но несколько идей оказались суперуспешными. И даже те, что были оставлены, сыграли свою роль, заставляя совершенствоваться тем подходам, которые выжили, иначе им бы не удалось избежать печальной участи. Это была жесточайшая гонка! Как же теперь, после того, как ситуация более или менее устаканилась, выглядит «пейзаж после битвы»?
Лидирующее положение занимают методы, основанные на идее Сэнгера использования ДНК-полимеразы, они коллективно называются методами «секвенирования посредством синтеза». Самый успешный из них, который лежит в основе секвенатора, выпускаемого компанией «Иллюмина», даже использует идею Сэнгера по терминации синтеза. Но секвенатор «Иллюмины» примерно так же напоминает примитивный аппарат Сэнгера, как беспилотный электромобиль – ручную тачку. Все этапы в секвенаторе компании «Иллюмина» полностью роботизированы, это подлинный триумф инженерной мысли.
Остальные подходы в рамках «секвенирования посредством синтеза» не используют терминирования синтеза. В подходе, называемом пиросеквенирование, используется тот факт, что при присоединении ДНК-полимеразой очередного нуклеотида высвобождается дифосфатная группа, называемая пирофосфатом. Регистрация этого события, появление пирофосфата, лежит в основе метода пиросеквенирования. Метод был доведен до прибора, но он не выдержал конкуренции, и соответствующая компания обанкротилась. Более успешной оказалась сходная идея, основанная на том, что, кроме пирофосфата, при присоединении нуклеотида высвобождается еще один протон, т. е. ион Н+, что приводит к микроскопическому изменению pH в микролунке, сделанной в чувствительном к pH полупроводниковом материале, где идет ДНК-полимеразная реакция. В этом методе полупроводникового секвенирования изменение pH удается детектировать электроникой, так что в данном подходе последовательность читается непосредственно компьютером, а не путем превращения оптического сигнала в электрический, как это делается и в методе Сэнгера, и в машине «Иллюмины», и в случае пиросеквенирования. Это большое преимущество метода полупроводникового секвенирования, и соответствующая компания успешно конкурирует с компанией «Иллюмина».
Особняком стоит метод секвенирования индивидуальной молекулы ДНК, основанный на использовании нанопор. Вот уж воистину нанотехнология par excellence! Этот метод не принадлежит к разряду «секвенирования посредством синтеза». Если секвенаторы компании «Иллюмина» представляют собой громоздкие приборы, а приборы для полупроводникового секвенирования хоть и компактнее, но все же достаточно крупные, то устройство для секвенирования при помощи нанопор, MinION, выпускаемое компанией Oxford Nanopore, и прибором не назовешь, это устройство чуть больше обычной флешки, которое имеет USB-интерфейс. Подобно флешке, MinION вставляется в USB-порт компьютера, на него наносится капля, содержащая ДНК, и через короткое время в памяти компьютера оказывается записанной последовательность нуклеотидов этой ДНК. Как же работает это чудо-устройство?
Рис. 20. Прохождение ДНК через нанопору. В мембране, разделяющей ячейку на две половины, проделано отверстие диаметром около 4 нм. Это и есть нанопора. В обеих половинах ячейки находится солевой раствор (диссоциированные ионы соли обозначены точками), но молекулы ДНК первоначально находятся только в той половине, к которой приложено отрицательное напряжение. Ток в ячейке измеряется амперметром (А)
Основу нанопор-секвенатора составляют миниатюрные камеры, к которым подведено электрическое напряжение (рис. 20). Камера разделена на две части при помощи очень тонкой мембраны и заполнена буфером, т. е. подсоленной водой с определенным значением pH. В одну из двух половин, ту, к которой подключен «—» постоянного тока, вводится одноцепочечная ДНК. В мембране сделана малюсенькая дырка диаметром в несколько нанометров, одна на всю мембрану, которая и есть та самая нанопора. Если никаких молекул ДНК в камере нет, через камеру протекает ток определенной силы, вызванный прохождением ионов соли сквозь мембрану, через нанопору. Если ввести молекулу ДНК, то, подобно ситуации с электрофорезом, которую мы уже обсуждали в этой главе, ДНК начнет мигрировать от отрицательно к положительно заряженной половине камеры. После многочисленных неудачных попыток ДНК начнет пролезать через нанопору. Что будет с током? Он упадет, ведь пока молекула ДНК пролезает сквозь нанопору, она блокирует существенную часть поперечного сечения нанопоры, и ионам остается меньше места для прохождения сквозь мембрану, электрическое сопротивление мембраны увеличивается, и, соответственно, ток падает. Чтобы сделать из нанопоры секвенатор, надо было добиться, чтобы ток, протекающий через нанопору, зависел от того, какая последовательность нуклеотидов проходит в данный момент сквозь нанопору.
Добиться этого оказалось очень трудной задачей, над которой начиная с середины 1990-х годов, когда впервые возникла идея нанопорового секвенирования, бились многие. Наиболее упорным оказался оксфордский профессор Хаган Бейли. У Бейли была мечта: он представлял себе визит пациента к доктору в XXI веке следующим образом. Прежде чем начать осмотр пациента, доктор просит его плюнуть на флешку, которая является нанопоровым секвенатором, вставляет флешку в порт своего компьютера и только после этого начинает медосмотр. Пока доктор измеряет пациенту давление, кардиограмму, спрашивает о жалобах, в его компьютер загружается полная последовательность нуклеотидов генома пациента. Компьютер сам, при помощи облачных технологий и самых современных баз данных, проводит полный анализ генома пациента на предмет его предрасположенности к различным болезням и т. д. К концу осмотра доктор уже имеет в своем распоряжении все эти данные в виде готовых рекомендаций того, какие дальнейшие тесты пациенту необходимо пройти.
Принципиальным моментом на пути создания нанопорового секвенатора была замена простой дырки в мембране на специальный белок с нанопорой внутри, альфа-гемолизин. Этот белок вырабатывается бактерией в качестве токсина, убивающего живую клетку. Белок представляет собой цилиндр с дыркой вдоль оси, так что, когда он внедряется в клеточную стенку, в стенке появляется дырка, и клетка погибает. Нанопора в гемолизине как раз нужного диаметра, так что однонитевая ДНК в нее пролезает, но с трудом, и разные нуклеотиды блокируют пору в разной степени. Бейли еще несколько изменил аминокислотную последовательность белка при помощи генной инженерии и добился существенного улучшения способности белковой нанопоры различать нуклеотиды, проходящие сквозь нее.
