Внутри фаговой частицы ДНК фага λ линейна, но у нее есть «липкие» концы – однонитевые взаимно комплементарные участки, содержащие по 12 нуклеотидов, т. е. она выглядит примерно так:
Если такой ДНК дать возможность свободно плавать в растворе, то «липкие» концы сомкнутся и ДНК превратится в кольцо. Поскольку эта молекула довольно длинная (в ней около 50 тысяч пар нуклеотидов), то при замыкании в кольцо она с довольно высокой вероятностью завяжется в узел.
Вспомним, что двухцепочечная ДНК – это очень жесткая цепь, один ее сегмент содержит около 300 пар оснований. Поэтому оценивать вероятность образования узла в двунитевой ДНК можно с помощью графика, приведенного на рис. 36 и основанного на компьютерных расчетах. По нему выходит, что около половины молекул ДНК фага λ при замыкании должны образовать узлы. Беда в том, что для такой длинной ДНК очень трудно отличить нетривиальный узел от тривиального. Во всяком случае пока это сделать не удалось. Липкие концы нужны ДНК фага λ как раз для того, чтобы замыкаться в кольцо, попадая в клетку-хозяйку. Если она не замкнется, то не сможет реплицироваться и вообще нормально работать (если, конечно, можно назвать работой тот разбой, который она учиняет, попав в кишечную палочку).
И вот тут возникает вопрос, на который необходимо найти ответ. А что будет, если при замыкании в кольцо ДНК завяжется в узел – ведь теория показывает, что это вполне вероятно? Не повредит ли это ее работе в клетке? Ведь вирусная ДНК должна произвести множество копий самой себя. Если завязывание в узел мешает этому, то, значит, в клетке должны существовать специальные механизмы, препятствующие образованию узлов. Но что это за механизмы?
Убедиться в том, что ДНК, завязанной в узел, будет трудно удваиваться, вы можете сами. Возьмите полоску бумаги и склейте из нее нетривиальный узел, например трилистник. Затем ножницами разрежьте полоску вдоль, на две половины. Это будет моделировать удвоение ДНК, во всяком случае один из возможных вариантов удвоения. Вы увидите, что вам не удастся развести два образовавшихся узла. Эти вопросы были подняты нами в уже упоминавшейся статье в журнале Nature. Ответ пришел спустя пять лет.
В 1980 году Л. и Ч. Лю и Б. Олбертс сообщили, что после многолетних поисков им удалось наконец подобрать условия, в которых обычная двунитевая ДНК образует узлы. Они работали не с ДНК фага λ, в которой узлы трудно обнаружить из-за большой длины, а с короткими кольцевыми молекулами. Оказалось, что если к таким молекулам добавить одну из топоизомераз в большом избытке, то очень эффективно идет образование узлов. Об их возникновении можно судить по тому, что в геле при электрофорезе появляются фракции ДНК с большой подвижностью. Авторы пошли дальше – обработали заузленные молекулы топоизомеразой, но взятой в низкой концентрации и в присутствии АТФ. Что же произошло? Узлы развязывались!
Последнее событие произошло в полном соответствии с теорией, так как использовавшаяся ДНК была короткой и равновесная доля узлов в ней не должна была превышать 5 %.
Образование узлов при избытке фермента вызвано, по-видимому, тем, что белок, связываясь с ДНК, меняет физические свойства молекулы, прежде всего усиливает слипание удаленных вдоль цепи звеньев. Как показывают расчеты, такое слипание должно резко увеличивать вероятность образования узла.
Открытие американских ученых вызвало целый поток аналогичных публикаций. Немедленно для получения узлов были применены методы генной инженерии.
Итак, топоизомеразы явно делились на две группы. Одни делают узлы на однонитевых ДНК. Их стали называть топоизомеразами I, другие специализируются на двунитевых молекулах, их назвали топоизомеразами II.
Но это были еще не все новости. Выяснилось, что топоизомеразы II, к которым относится и ДНК-гираза, не только умеют завязывать и развязывать узлы, но и объединяют две или более молекулы ДНК в катенаны (т. е. делают их зацепленными).
Способность белков образовывать узлы вызвала большой интерес. Прежде всего она позволила понять, как работают топоизомеразы и, в частности, важнейший фермент этого класса – гираза. Ведь завязать кольцевую замкнутую ДНК в узел невозможно, не разорвав двойную спираль. Но мало просто разорвать цепь. Нужно еще протащить через образовавшуюся брешь другую часть молекулы, а потом заделать брешь. Вот какую сложную работу проделывает топоизомераза II.
Получается, что ДНК в присутствии этого фермента ведет себя так, будто на нее не распространяется запрет материальным телам проходить друг сквозь друга. Конечно, все дело здесь в ферменте – без него ничего не получилось бы. Ведь ДНК – не электрон или α-частица, для которых возможен эффект квантового туннелирования. Топоизомеразы позволяют ДНК вести себя в клетке не менее странным образом.
Это как если бы вы, играя в теннис, попали мячом в сетку, а он взял и преспокойненько пролетел бы сквозь нее. Но, подбежав к сетке, вы не обнаруживаете дырки, сетка совершенно цела и невредима. Теперь ясно, как клетка решает ДНКовые топологические проблемы и, в частности, проблему репликации заузленных молекул.
Можно ли на основе сказанного понять, как ДНК-гираза меняет сверхспирализацию ДНК? Оказывается, можно. На рис. 37 видно, что если протаскивать один участок ДНК сквозь другой, то возникает сверхспираль, так как меняется величина райзинга, причем Wr всегда меняется на ±2. Именно это было и обнаружено экспериментально. В отличие от топоизомераз I, меняющих Lk ДНК на любое целое число, топоизомеразы II меняют Lk только на четное число. Дальнейшие исследования показали, что и работа топоизомераз типа I также идет путем образования разрывов и протаскивания цепи через образовавшуюся брешь. Только в отличие от топоизомераз типа II топоизомеразы I проделывают этот трюк не с двойной спиралью, а с однонитевой ДНК, так что, по-видимому, узлы в однонитевой ДНК завязываются топоизомеразой I точно так же, как узлы в двунитевой молекуле – топоизомеразой II.
Рис. 37. Три «топологические реакции», катализируемые топоизомеразой II; а – изменение числа витков сверхспирали ∆Lk = ±2); б – развязывание и завязывание узлов: в – расщепление и образование катенанов
Открытие топоизомераз и выяснение механизма их работы лишило почвы одно из основных возражений против двойной спирали, всплывавшее вновь и вновь за прошедшие с момента открытия двойной спирали десятилетия. Очень многих в течение этих лет смущало то, что ДНК должна раскручиваться при репликации. Неужели она крутится в клетке, словно тросик спидометра?
Разные люди относились к этому по-разному. Одним это не казалось странным. Другие отмахивались – мол, как-нибудь все уладится. Третьи придумывали хитроумные объяснения. Один физик-теоретик, например, утверждал, что одна цепь может пройти сквозь другую путем квантового туннелирования. И наконец, были такие, кто усматривал в этом явный дефект модели Уотсона—Крика. Они настаивали на том, что по крайней мере в клетке ДНК – не двойная спираль.
