Как же это следовало понимать? Может быть, однонитевая эндонуклеаза предпочтительно атакует такие последовательности, даже если они находятся в нормальной В-форме? Или эти последовательности способны принимать в сверхспиральной ДНК какую-то новую, до сих пор не обнаруженную форму ДНК?
Последняя возможность была особенно интересной, поскольку это означало бы, что мы еще не знаем о структуре ДНК что-то очень важное, причем это «что-то» могло оказаться существенным для функционирования ДНК в клетках эукариот. Специалисты по структуре ДНК взялись за работу, пытаясь выяснить образуют ли гомопурин-гомопиримидиновые последовательности альтернативную структуру, а если образуют, то какую именно.
Возможно, рассуждали одни, эти последовательности могут образовывать левую спираль, не Z-форму, а какую-то другую левоспиральную форму, одну из тех, что можно построить с помощью молекулярных моделей. Нет, возражали другие, все дело в том, что это очень однородные последовательности и поэтому две комплементарные нити могут проскальзывать друг относительно друга, образуя две однонитевых петли по краям гомопурин-гомопиримидинового участка. Однонитевая эндонуклеаза атакует эти петли, что и делает такие последовательности гиперчувствительными. А может быть, указывали третьи, такие последовательности образуют четверные спирали, еще одну гипотетическую структуру, предложенную теоретиками на основе «игры» с молекулярными моделями. Однонитевая эндонуклеаза атакует вершину такой структуры, где должны быть однонитевые петли.
Очень скоро стало ясно, что сам по себе факт гиперчувствительности к однонитевой эндонуклеазе мало что дает, тем более что оставался открытым вопрос об избирательном действии самого фермента. В начале 1985 года В. Лямичев, С. Миркин и автор этих строк (мы тогда работали в Москве, в Институте молекулярной генетики
[3]) решили применить к исследованию этого запутанного вопроса метод двумерного гель-электрофореза.
Была сконструирована плазмида, несущая последовательность (ГА)16 •(ТЦ)16. Топоизомеры этой плазмиды были подвергнуты разделению методом двумерного электрофореза. На картинах электрофореза наблюдались характерные разрывы, как в случае крестов и Z-формы. Эти разрывы отсутствовали в контрольных экспериментах с плазмидой, в которую не был встроен участок (ГА)16 •(ТЦ)16. Пятна, отвечающие следующим за разрывом топоизомерам, исчезли из картин двумерного фореза после обработки плазмиды со вставкой однонитевой эндонуклеазой. Эти опыты показали, что под действием отрицательной сверхспирализации в гомопурин-гомопиримидиновой последовательности на самом деле образуется некая альтернативная структура. Но, может быть, образуется одна из уже известных альтернативных структур, крест или Z-форма, просто требования к последовательности на самом деле не столь строги, как принято считать?
Эта возможность полностью исключалась, так как обнаруженный переход оказался очень чувствительным к кислотности среды. При добавлении в среду кислоты переход резко облегчался. Более того, при достаточной кислотности переход наблюдается вообще в релаксированной, несверхспирализованной ДНК! Стало ясно, что речь идет на самом деле о какой-то совершенно новой структуре, поскольку ни одна из известных ранее структур не была столь чувствительной к кислотности среды. Так как эта загадочная структура стабилизировалась кислотой, т. е. ионами водорода, мы назвали ее Н-формой.
У нас в руках были две очень важные количественные характеристики Н-формы. Во-первых, величина скачка при электрофорезе, которая свидетельствовала о том, что в Н-форме комплементарные цепи не закручены друг относительно друга (как и в случае крестов). Во-вторых, зависимость сверхспирализации, при которой происходит переход из В – в Н-форму, от кислотности среды. Теоретический анализ этой зависимости показывал, что в Н-форме на каждые четыре пары оснований вставки (ГА)16 •(ТЦ)16 приходится одно место связывания протона. Нам никак не удавалось придумать структуру, которая бы удовлетворяла этому требованию.
В то время, когда мы ломали головы над этой загадкой, наше внимание привлекла статья А. Р. Моргана и Джероми Ли (Университет Альберты, Канада), опубликованная несколькими годами раньше. Канадские ученые исследовали синтетическую ДНК, комплекс поли (ЦТ) •поли (АГ). Они обнаружили, что в кислой среде пара таких двойных спиралей объединяется в тройной комплекс, состоящий из двух цепей ЦТ и одной цепи АГ. Вторая цепь АГ оказывается «лишней». Тройной комплекс состоит из триад, структура которых приведена на рис. 42. Для нас очень существенно то, что триада ЦГЦ+ образуется путем захвата из среды одного протона. Это и объясняет, почему такая структура образуется, в отсутствие сверхспирального напряжения, только в кислой среде. На основе этих данных мы предположили, что Н-форма имеет структуру, показанную на рис. 43.
Рис. 42. Структура триад ТАТ и ЦГЦ+, из которых строится тройная спираль ДНК. В основе каждой триады лежат обычные уотсон-криковские пары А •Т и Ц •Г (см. рис. 38), к которым присоединяется третье основание. Такой необычный способ присоединения оснований впервые наблюдал в кристаллах К. Хугстин. Для образования хугстиновской пары ГЦ цитозин должен захватить из раствора лишний ион водорода, т. е. протон. Штриховыми линиями показаны водородные связи между основаниями. Как и в случае уотсон-криковских пар, обе триады имеют одинаковые расстояния между атомами азота, связанными с сахаром
Рис. 43. Структура Н-формы ДНК для участка (ГА)16 •(ТЦ)16, встроенного в плазмидную ДНК. Основной элемент структуры – тройная спираль, состоящая из триад, приведенных на рис. 42. Показаны два возможных «изомерных» варианта структуры. Уотсон-криковское спаривание обозначено затемненными кружками, хугстиновское спаривание ГЦ, в котором участвует дополнительный протон, обозначено крестиками
Ясно, что такая структура должна быть очень чувствительна к однонитевой эндонуклеазе, так как половина пуриновой нити вставки находится в однонитевом состоянии.
Мы исследовали также вставки (Г)n •(Ц)n и другие регулярные гомопурин-гомопиримидиновые последовательности. Во всех случаях наблюдалось образование Н-формы.
Так что же, Н-форма может возникнуть в любой гомопурин-гомопиримидиновой последовательности? Нет, согласно модели (рис. 42), гомопурин-гомопиримидинового характера последовательности недостаточно. Требуется еще, чтобы последовательность была зеркальным перевертышем, т. е. чтобы она одинаково читалась справа налево и слева направо по одной и той же цепи (в отличие от обычных перевертышей, образующих кресты, которые одинаково читаются по разным цепям). Понятно, почему все регулярные гомопурин-гомопиримидиновые последовательности образуют Н-форму – ведь они как раз принадлежат к классу зеркальных перевертышей. Легко, однако, придумать нерегулярную последовательность – зеркальный перевертыш, скажем:
