Генная инженерия как принципиально новая технология возникла в значительной мере на базе достижений, которых ученые добились при изучении молекулярных процессов, которые происходят в бактериальной клетке. Было сделано несколько важных открытий, прежде чем исследователи научились легко и направленно манипулировать с ДНК, а не просто смешивать фрагменты ДНК с бактериями и отбирать среди них случайно возникающие варианты (рекомбинанты).
Бактерии имеют высокоэффективный механизм защиты от чужеродной ДНК. Исследование этой проблемы привело к обнаружению в бактериях специальных ферментов, получившие название рестриктаз. Первые из них получены еще в 1970 г. Сейчас уже выделено несколько сот разнообразных рестриктаз из клеток разных видов бактерий. Каждый из таких ферментов «узнает» строго определенные короткие (обычно 4–6 п. н.) нуклеотидные последовательности ДНК, которые чаще всего представляют собой палиндромы, и разрезает ДНК на фрагменты по этим участкам. В результате этих свойств рестриктазы стали незаменимым инструментом в исследовании генома, своеобразным скальпелем для ДНК.
Большой удачей для экспериментаторов было то, что в большинстве случаев при нарезании рестриктазами ДНК образующиеся фрагменты содержат «липкие» концы, т. е. способны в дальнейшем соединяться друг с другом. Для восстановления химической связи таких слипшихся фрагментов стали использовать еще один новый класс ферментов — лигазы. Так появились первые инструменты, позволяющие целенаправленно манипулировать с молекулами ДНК in vitro. Следующий важный этап — размножение сконструированных рекомбинантных ДНК, чтобы можно было с ними работать дальше. Для этой цели стали использовать специальные ДНК — векторы, которые представляют собой или бактериофаги, или внехромосомные кольцевые молекулы — плазмиды, которые обладают способностью размножаться в бактериальных клетках. Если любой фрагмент ДНК внести в состав ДНК бактериофагов или плазмид, то при переносе в бактериальные клетки он будет там размножаться вместе с вектором. Наконец, были разработаны специальные подходы для отбора бактериальных клеток, в которых содержатся необходимые рекомбинантные ДНК. Все эти достижения позволили проводить клонирование ДНК, т. е. выделять из сложной смеси молекул определенные участки ДНК и размножать их.
Клонирование фрагментов ДНК дало в руки исследователей принципиально новый подход к выделению из сложной смеси ДНКовых фрагментов конкретных индивидуальных последовательностей. При этом они могли содержать осмысленные тексты (гены) или не содержать таковых. Традиционная биохимия не могла обеспечить подобную процедуру в силу того, что различные фрагменты ДНК химически очень сходны. Но генной инженерии это оказалось вполне под силу. Схематически процесс клонирования ДНК изображен на рис. 13.
Рис. 13. Схема процесса клонирования ДНК с использованием в качестве вектора бактериальной плазмидной ДНК
После разрезания ДНК на фрагменты с помощью рестриктазы все они соединяются ковалентно с вектором (вектор разрезан той же рестриктазой) в результате «слипания» концов молекул и последующей обработки «гибридов» лигазой. Так в пробирке создается искусственная или рекомбинантная ДНК. Затем осуществляют перенос множества образовавшихся рекомбинантных молекул в бактериальные клетки — трансформацию. Особенность процесса трансформации заключается в том, что в одну бактериальную клетку попадает лишь одна рекомбинантная молекула ДНК. После этого, благодаря отбору, размножаются только бактерии с рекомбинантными ДНК, содержащими требуемые нуклеотидные последовательности.
Для изучения структуры генома необходимо не только клонировать все его участки в виде рекомбинантных молекул, но, главное, расшифровать в них последовательность нуклеотидов, т. е. «прочесть» ДНКовый текст.
Важным моментом во всей этой генно-инженерной «кухне» было создание принципиально новой технологии размножения индивидуальных фрагментов ДНК in vitro. Этот удивительно простой метод получения фрагментов ДНК в неограниченном количестве копий был придуман при необычных обстоятельствах — ночью, во время автомобильной поездки в горах Калифорнии. Автор этой идеи нобелевский лауреат Кэри Б. Мюллис так вспоминает момент озарения. «Иногда удачная идея приходит в голову совершенно неожиданно. Со мной, например, это случилось в одну из апрельских ночей в 1983 г., когда я, сидя за рулем автомобиля, пробирался по освещенной луной горной дороге в секвойные леса Северной Калифорнии. Мысль моя случайно натолкнулась на процесс, благодаря которому можно получать копии генов в неограниченных количествах. Теперь он называется «полимеразной цепной реакцией». За создание новой технологии ее автор получил Нобелевскую премию.
Полимеразная цепная реакция (сокращенно ПЦР) дает возможность в течение дня из одной молекулы ДНК получать 100 миллиардов идентичных по структуре молекул. Эта реакция довольно проста в исполнении: нужны лишь ДНК, пробирка, несколько реагентов и источник нагревания и охлаждения. Препарат ДНК, который необходимо копировать, может быть получен и из кусочка ткани, и из капли засохшей крови, и из засушенной мумии, и даже из тела мамонта, пролежавшего несколько тысяч лет в вечной мерзлоте. Суть этого метода изображена на рис. 14 на цветной вклейке.
Сама процедура ПЦР заключается в следующем. Прежде всего, ДНК денатурируют, нагревая ее до 98 °C. При этом две цепи ДНК, относительно слабо связанные между собой, разделяются друг от друга. Далее в ход идут так называемые затравки (праймеры) — короткие однонитевые фрагменты ДНК, которые комплементарны краям того участка генома, который собираются размножать (амплифицировать). Эти затравки гибридизуются с комплементарными участками однонитевых молекул ДНК, после чего специальный фермент (ДНК-полимераза) удлинняет затравки, строя молекулу ДНК по матрице (цикл 1). Затем продукты реакции вновь денатурируют и процедуру повторяют необходимое число раз. За 20–30 циклов из одной молекулы можно получить миллионы копий ДНК. Этот процесс подобен цепной ядерной реакции, но осуществляется в пробирке с помощью специального фермента — термостабильной ДНК-полимеразы. По этой причине он и получил название полимеразной цепной реакции.
Рис. 14. Схема протекания полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Конечная цель — определение полной последовательности нуклеотидов в ДНК человека
Длительное время искали эффективные методы, позволяющие определять последовательность нуклеотидов в длинных молекулах ДНК (такое определение нуклеотидной последовательности получило название секвенирование, от анг. sequence — последовательность). Только в середине 70-х годов секвенирование протяженных участков ДНК стало возможным. Связано это было с изобретением принципиально новых подходов. В 1976 г. А. Максамом и У. Гилбертом был разработан метод прямого секвенирования, основанный на химической деградации ДНК. В данном случае осуществляется специфическая химическая фрагментация длинной цепи ДНК (полинуклеотида), радиоактивно меченной с одного конца. Затем препарат меченой ДНК разделяют на четыре порции и каждую из них обрабатывают реагентом, модифицирующим одно или два из четырех оснований, содержащихся в ней. После разделения в специальном геле меченых фрагментов по размерам (с помощью электрофореза) на рентгеновских пленках смотрят, что при этом происходит с нуклеотидной последовательностью, и на основании этого делают вывод о порядке расположения нуклеотидов друг за другом в каждом фрагменте ДНК. Однако метод оказался довольно сложным. В становлении этого метода на его начальных этапах существенную роль сыграл российский ученый академик А. Д. Мирзабеков, работавший в лаборатории У. Гилберта.
