На практике более опасна другая ситуация — ложноотрицательная реакция при ИФА, которая изредка (в 1–5 %) встречается при обследовании пациентов (анализ показывает, что вируса нет, а на самом деле он присутствует и делает уже свое черное дело). Вполне естественно, что успокоенный благоприятным результатом, но на самом деле ВИЧ-инфицированный, человек не принимает никаких мер по борьбе с собственной инфекцией. B результате заболевание развивается без лечения, а человек становится источником новых заражений. Ложноотрицательная реакция при ИФА связана с несколькими причинами. Во-первых, хорошо известно, что антитела к вирусу иммунодефицита человека вырабатываются не мгновенно после его проникновения в организм человека. Период, когда вирус уже присутствует в крови, а антитела еще не появились, называется «серологическим окном». B период «окна», несмотря на высокое содержание ВИЧ в крови, тест будет отрицательный, т. е. ложноотрицательный. Но в данный период инфицированный человек уже может передавать вирус другим людям. Обычно заметное количество антител к ВИЧ появляется в крови через две-десять недель после заражения. Однако применительно к каждому человеку разброс во времени может быть весьма велик. Так, у 90–95 % зараженных они обнаруживаются в течение трех месяцев после заражения, у 5–9 % — через шесть месяцев от момента заражения, а у 0,5–1 % — даже в более поздние сроки. Наиболее ранний срок обнаружения антител — две недели от момента заражения. Поэтому при наличии данных, свидетельствующих о контакте пациента с инфицированными ВИЧ, обычно проводят повторные исследования через два-три месяца. Так обстоит дело у взрослых.
Еще сложнее ситуация у новорожденных детей. Как у зараженных, так и у незараженных детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей, в первые 6—12 месяцев жизни практически всегда обнаруживаются антитела к ВИЧ. Но они имеют материнское происхождение и затем могут или сохраниться, или исчезнуть. Только по прошествии 18 и более месяцев обнаружение антител к ВИЧ служит для врачей важнейшим критерием, свидетельствующим о наличии у ребенка ВИЧ-инфекции. Отсутствие антител к ВИЧ у ребенка в возрасте 18 месяцев, рожденного от инфицированной ВИЧ матери, считается сегодня однозначным указанием против наличия у него вируса.
Итак, ложноотрицательная реакция при ИФА может получаться тогда, когда анализ производят на самой начальной стадии инфекции. Такая же реакция возможна и на конечных этапах развития болезни, когда иммунитет пациента ослаблен настолько, что антитела к ВИЧ практически перестают вырабатываться.
Несмотря на определенные ограничения, ИФА был и остается основным методом, который используется сегодня для обнаружения ВИЧ-инфекции в многочисленных диагностических лабораториях и центрах как в России, так и за рубежом. Для этой цели используют разнообразные диагностические наборы, которые производятся и у нас в стране, и в других странах мира. Причем специалисты считают, что даже лучшие зарубежные диагностикумы ничем не превосходят по чувствительности и надежности российские аналоги, а по цене они существенно им уступают.
Иммуноблоттинг — дополнительный непрямой метод
Кроме ИФА в определенных случаях для тестирования ВИЧ-инфекции используют процедуру, называемую «иммуноблоттинг» или «иммунный блоттинг» (иногда называют еще «вестерн-блот»). По рекомендации ВОЗ иммуноблотинг используется при диагностике ВИЧ-инфекции в качестве дополнительного экспертного метода, который должен подтверждать результаты ИФА. Обычно этим методом перепроверяют положительный результат при ИФА, поскольку он считается более чувствительным и специфичным, хотя более сложным и дорогим. Но прежде чем подписать окончательный приговор пациенту, врач должен убедиться полностью в правильности диагноза. Поэтому вопрос о сложности и дороговизне здесь не может быть решающим.
Как по назначению, так и по способу исполнения к иммунному блоттингу хорошо подходит известное выражение «вывести на промокашку». Иммунный блоттинг сочетает в себе иммуноферментный анализ (ИФА) с предварительным электрофоретическим разделением белков вируса в геле и их переносом на нитроцеллюлозную мембрану («промокашку»). Процедура иммуноблота состоит из нескольких стадий (рис. 27). Сначала предварительно очищенный и разрушенный до составных компонентов ВИЧ подвергается электрофорезу, при этом все входящие в состав вируса антигены разделяются по молекулярному весу. Затем методом блоттинга (аналог выдавливания на «промокашку» избытка чернил) антигены переносят из геля на полоску нитроцеллюлозы или нейлонового фильтра, которые отныне содержат невидимый пока глазом спектр белков, характерный для ВИЧ. Далее на стрип наносится исследуемый материал (сыворотка, плазма крови пациента и т. п.), и если в пробе есть специфические антитела, то они связываются со строго соответствующими им полосками белков-антигенов. В результате последующих манипуляций (подобных ИФА) результат этого взаимодействия визуализируется — делается видимым. В конечном итоге наличие полос на определенных участках стрипа подтверждает присутствие в исследованной сыворотке антител к строго определенным антигенам ВИЧ.
Иммунный блоттинг чаще всего используют для подтверждения диагноза ВИЧ-инфекции. ВОЗ считает положительными сыворотки, в которых методом иммунного блотинга обнаруживаются антитела к каким-либо двум белкам оболочки ВИЧ. Согласно этим рекомендациям, при наличии реакции только с одним из белков оболочки (gp160, gp120, gp41) в сочетании или без реакции с другими белками результат считается сомнительным и рекомендуется повторное исследование с использованием набора другой серии или другой фирмы. Для подстраховки, если
Рис. 27. Для проведения иммуноблотинга на первом этапе белки, содержащиеся в сыворотке крови, разделяют в геле по их молекулярной массе и заряду с помощью электрического поля (методом электрофореза в геле). Затем на гель накладывают нитроцеллюлозную или нейлоновую мембрану и «промокают» (это и есть блоттинг). Это осуществляют в специальной камере, которая позволяет осуществить полный пернос материала из геля на мембрану. B результате та картина расположения белков, которая была на геле, воспроизводится на мембране (блот), с которой можно далее легко манипулировать. Первоначально мембрану обрабатывают антителами к искомому антигену, а после отмывки несвязанного материала добавляют радиоактивно меченный коньюгат, который специфически связывается с антителами (как в ИФА). Местоположение образующегося комплекса «антиген-антитело — меченый коньюгат» определяют с помощью авторадиографии с использованием рентгеновской пленки. После ее проявления становится ясным, есть ли антигены в крови или их нет и после этого результат остается сомнительным, рекомендуется последующее наблюдение в течение шести месяцев (исследования продолжаются через каждые три месяца).
B настоящее время в РФ для использования при диагностике ВИЧ-инфекции рекомендовано использовать пять тест-систем, среди которых имеются как российские, так и зарубежные.
ПЦР — высокочувствительный прямой метод
Аббревиатура ПЦР расшифровывается «полимеразная цепная реакция». За создание этого потрясшего мир метода ее первооткрывателю Керри Мюллису в 1993 г. была присуждена Нобелевская премия. Все гениальное — просто. Это можно сказать и о ПЦР. За свою чувствительность, изящность и точность новый метод с быстротой молнии распространился по всему миру. B настоящее время ПЦР используется для проведения научных и практических исследований, но прежде всего этот метод нашел широкое применение в области вирусной и микробиологической диагностики. ПЦР позволяет найти в исследуемом клиническом материале небольшой участок генетической информации (несколько десятков — несколько сотен пар нуклеотидов ДНК или РНК) любого организма, содержащийся в следовых количествах среди огромного количества нуклеотидных последовательностей иной природы, и быстро многократно размножить его.
