ПЦР имеет мало общего с хорошо всем известной ядерной цепной реакцией, происходящей при делении атомных ядер под действием нейтронов. Общность заключается только в том, что в обоих случаях реакция цепная, т. е. очень сложная, усиливающаяся в геометрической прогрессии. По сути дела, метод ПЦР имитирует в пробирке естественную репликацию ДНК, только повторяющуюся с огромной скоростью и столько раз, сколько это необходимо исследователю. Метод включает несколько этапов: расплетание двойной спирали ДНК, расхождение нитей ДНК и последующее комплементарное дополнение (достройку) обеих с помощью специального фермента. Репликация ДНК может начаться не в любой точке, а только в определенных стартовых блоках — коротких двунитевых участках. Для того чтобы осуществить такой процесс в пробирке, используют две генетические пробы (праймеры), которые и служат в качестве затравки для синтеза второй цепи на однонитевой ДНК. Праймеры — это искусственно синтезированные короткие нуклеотидные последовательности (15–30 нуклеотидов), комплементарные концам размножаемых (амплифицируемых) участков нитей ДНК. Понятно, что, чтобы иметь нужные праймеры, необходимо знать нуклеотидную последовательность того участка ДНК, который требуется размножить. Суть метода ПЦР отображена на рис. 28 .
Рис. 28. Метод ПЦР весьма чувствительный, его проведение требует большой предосторожности. Необходимые пояснения см. на рисунке и в тексте.
Сначала двунитевую ДНК нагревают до температуры около 100о С. При этом комплементарные нити ДНК расходятся между собой (ученые говорят — ДНК денатурирует). Затем к обеим нитям ДНК по принципу комплементарности присоединяют искусственно синтезированные праймеры, в результате чего образуются короткие двунитевые «стартовые» участки. Далее в действие вступает специфический бактериальный фермент — Taq-полимераза. Кроме способности синтезировать ДНК эта полимераза обладает еще одной важной особенностью: она устойчива к высоким температурам, при которых другие белки теряют свои свойства. Термоустойчивая полимераза осуществляет in vitro (т. е. в пробирке) синтез вторых цепей ДНК на каждой из двух денатурированных цепей. После нового прогрева до 100о С уже вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации — это и есть цепная реакция ПЦР. В результате такого «тиражирования» в пробирке уникальных участков генов вируса или бактерий за два-три часа количество копий фрагмента ДНК увеличивается в геометрической прогрессии, и через 25 циклов амплификации синтезируется 106 копий фрагмента. Такое количество ДНК уже достаточно, чтобы визуально ее регистрировать с помощью простых приемов, которые уже давно используются молекулярными биологами.
С момента возникновения метод ПЦР постоянно совершенствовался, и в настоящее время он позволяет выявлять в биологических объектах даже единичные вирусные частицы или бактерии. Чувствительность амплификационных тест-систем составляет от 1 до 100 вирусов, в то время как чувствительность иммунологических (не говоря уж о микроскопических) тестов на два-четыре порядка ниже. Кроме того, ПЦР имеет высокую специфичность, которая обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного вида возбудителя, фрагмент ДНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров и специально отрабатываемыми жесткими условиями их присоединения к матрице при проведении реакции. Соответственно, амплификационные тест-системы, в отличие от иммунологических тест-систем, позволяют избежать проблем, связанных с перекрестно реагирующими антигенами. И наконец, привлекательна быстрота получения результата при использовании ПЦР. За счет автоматизации определение возбудителя осуществляется обычно в течение одного рабочего дня. Правда, очень высокая чувствительность метода имеет и обратную сторону медали: реакция может происходить и при наличии незначительных примесей, случайно попавших в рабочие растворы, на инструменты и даже на хорошо вымытую посуду. От исследователей требуется сверхтщательное отношение к постановке эксперимента, особая культура в технологии проведения подобного рода анализа. Даже наличие одной молекулы вируса, случайно внесенной в реакцию извне (порой даже из воздуха), может дать положительный сигнал, хотя на самом деле в анализируемой крови вирус отсутствует (такой сигнал, как уже говорилось, называется ложноположительным).
ПЦР — метод, позволяющий оценивать наличие в крови как самого вируса, так и провируса (РНК или ДНК). Известная фирма «Ля Рош» активно разрабатывает и продвигает диагностические тест-системы, основанные на технологии ПЦР. Уже в 1994 г. эта компания выпустила первую коммерческую тест-систему под названием «AMPLICOR HIV-1 Monitor», с помощью которой можно было довольно точно и надежно измерить количество РНК ВИЧ-1 («вирусную нагрузку») в крови. Эта система и сегодня является единственной разрешенной Управлением по контролю качества продуктов и лекарств США (FDA) для измерения вирусной нагрузки. Чувствительность теста очень высока, когда речь идет о количестве определяемого материала. Он позволяет выявить наличие всего 50 копий вирусной РНК в 1 мл крови, что значительно чувствительней, чем у других диагностических тест-систем.
Диагностическая чувствительность оценивается в процентах и определяет долю пациентов с данным заболеванием, дающих истинно положительные результаты при использовании конкретного набора. Например, для французских наборов «Ампликор» диагностическая чувствительность составляет от 95 до 100 %. Российские фирмы-производители выпускают диагностикумы, сходные по этому показателю.
На сегодняшний день ПЦР-наборы для диагностики ВИЧ-инфекции не достигают диагностической чувствительности более 98 %, т. е. выявляют ВИЧ в среднем лишь у 98 из 100 ВИЧ-инфицированных людей, в то время как современные тест-системы, основанные на ИФА, имеют порой чувствительность, равную 99 % и даже более. Разница вроде бы и небольшая, но за ней стоят многочисленные человеческие судьбы. Каждая доля процента — это тысячи людей, у которых или вовремя не обнаружили ВИЧ, и это помешало начать экстренную медицинскую помощь, или наоборот — смертельно напуганных без всякой на то причины. Основная причина меньшей диагностической чувствительности ПЦР при высокой чувствительности самого метода — сильная вариабельность генома ВИЧ, на который она направлена.
Все приведенные оговорки никак не снижают важность метода ПЦР. Особую ценность для диагностики ВИЧ-инфекции ПЦР имеет на двух этапах: в самом начале, когда инфицирование уже произошло, а антитела еще не успели образоваться, и на поздних стадиях заболевания, когда количество антител может снижаться вплоть до полного исчезновения. Количественное определение РНК ВИЧ позволяет устанавливать уровень виремии («вирусную нагрузку»). С помощью ПЦР врачам очень удобно оперативно оценивать, как отражается на пациенте тот или иной вариант противовирусной терапии, который был применен в ходе его лечения.
Без антигенов и антител
Приведенные выше данные говорят об отсутствии единого «теста на СПИД». Это определяет в некоторых случаях необходимость использования и иных подходов. После обнаружения ВИЧ врачи обычно используют другие дополнительные тесты, в частности такие, как тест на пневмоцистную пневмонию (разновидность воспаления легких) и онкологию. Имеющий огромный опыт работы по диагностированию ВИЧ у населения академик B. B. Покровский пишет, что «диагностика любого инфекционного заболевания основана на сопоставлении эпидемиологических, клинических и лабораторных данных, и преувеличение значения одной из групп этих данных может привести к диагностическим ошибкам». Он отмечает также типичную ошибку, которая встречается при диагностике ВИЧ-инфекции: часто диагноз устанавливается на основании какого-нибудь одного лабораторного теста, к которому у врача по той или иной причине имеется чересчур сильное доверие. Иногда отдельные сотрудники лабораторий даже сами берут на себя смелость устанавливать диагноз ВИЧ-инфекции, никогда не видя самого больного, а только проанализировав присланную им кровь. А некоторые клиницисты безоговорочно доверяют результатам лабораторных исследований, которые могут служить только как отдельные свидетели в деле вынесения «окончательного приговора». Таким образом, постановка диагноза — дело очень тонкое и ответственное.
