Последовательность действий при изучении древней ДНК на первый взгляд проста. ДНК выделяют из образцов, проводят амплификацию методом ПЦР (поскольку материала обычно бывает мало, и другого случая исследовать тот же объект, возможно, не будет, часто стараются амплифицировать не только участки, интересующие в данный момент), а затем секвенирование. До появления методов NGS могли секвенировать отдельные гены, которые “вытаскивали” из образца методом гибридизации, либо использовали метод дробовика (shotgun sequencing): ДНК случайным образом расщепляют на фрагменты, потом секвенируют их и состыковывают с помощью компьютерной программы.
Метод дробовика (шотган-секвенирование) сделала популярным компания Крейга Вентера Celera Genomics, использовавшая его в проекте “Геном человека”. Именно с его помощью были прочтены первые геномы организмов. Суть его в получении множества сравнительно коротких фрагментов исследуемой ДНК (метод Сенгера не мог читать более 1000 нуклеотидов за один раз), секвенировании и состыковке с помощью мощного программного обеспечения. Важным преимуществом шотган-секвенирования (по сравнению с методичным клонированием крупных фрагментов, положение которых в геноме и друг относительно друга было известно) стала возможность автоматизации.
На словах все легко, на практике сложности начинаются с выделения ДНК из древних образцов. “Минимум требований – наличие трех комнат: в одной проводится экстракция ДНК, в другой амплификация, в третьей секвенирование. Работать с ДНК современных биологических видов необходимо в отдельном здании или хотя бы в помещении с отдельной вентиляцией, иначе велика вероятность загрязнения. Ранее считалось, что повторение результатов независимой лабораторией – непременное условие публикации, сейчас это ограничение снято”, – рассказывал Евгений Рогаев
[80].
Посторонняя ДНК – серьезная проблема, требования к помещениям и вентиляции возникли не на пустом месте. Загрязнителем может быть ДНК того же вида, к которому принадлежит объект исследования (весьма вероятный вариант, если речь идет о человеке) или преобладание ДНК других видов (например, почвенных микроорганизмов). Есть приемы, позволяющие не перепутать “чужую” ДНК с интересующей, однако они не всегда срабатывают. Специалисты помнят забавную (только не для авторов той статьи) историю 1990-х гг.: был опубликован участок митохондриального гена динозавра, жившего 80 млн лет назад
[81], а потом оказалось, что это человеческий ген. Дело в том, что в ядерной ДНК есть копии митохондриальных генов, накопившие мутации, – так называемые псевдогены, Авторы, конечно, проверили, прежде чем посылать статью в рецензируемый журнал, не похож ли отсеквенированный ими ген на известные митохондриальные гены современных видов, человека в том числе, и сходства не обнаружили, а вот человеческий псевдоген приняли за динозавровый. Но тогда палеогенетика была совсем молодой наукой, практически новорожденной, а с тех пор она шагнула далеко вперед.
Наконец, древняя ДНК может подвергаться химическим модификациям, взаимодействовать с другими органическими веществами. В ней могут происходить так называемые постмортальные мутации, заменяющие С на Т или А на G, и надо уметь это учитывать. Методы для этого есть. Поскольку каждый конкретный участок ДНК в образце обычно представлен как минимум несколькими молекулами, он и прочитывается несколько раз. Маловероятно, чтобы один и тот же аденин был заменен во всех фрагментах, поэтому по результатам секвенирования составляют консенсусную (усредненную) последовательность, имея в виду возможность постмортальных мутаций.
Группа Рогаева к тому времени имела значительный опыт работы с древней ДНК. В активе у них была, например, реконструкция полного митохондриального генома шерстистого мамонта. Исследования мтДНК мамонта – и немецкого Института эволюционной антропологии Макса Планка (тех самых людей, которые прославились исследованиями неандертальских и денисовских геномов)
[82], и Рогаева с соавторами
[83] – показали, что мамонт и индийский слон – более близкая родня между собой, чем с африканским слоном.
Для российской судмедэкспертизы анализ образцов из Екатеринбургского захоронения стал шагом вперед. Кстати, эксперты из Свердловского областного бюро в процессе сотрудничества с Евгением Рогаевым освоили новейшие методики, с помощью которых позднее производили идентификацию погибших при крушении самолета под Пермью 14 сентября 2008 г.
“Худший случай для анализа ДНК…”
Но вернемся к анализу образцов из екатеринбургского захоронения. Кроме Рогаева, в исследовании участвовали А. П. Григоренко, которая ставила полимеразные цепные реакции, и Ю. К. Моляка, проделавший значительную часть работы с мтДНК. Сам Евгений Рогаев проводил экстракцию ДНК из образцов и ее первые анализы. В числе соавторов названы и другие исследователи из научных центров России, США и Канады
[84].
Образцы выглядели не слишком вдохновляюще. С мамонтами было, вероятно, проще: тогда для работы использовали образец, извлеченный из вечной мерзлоты, сохранивший клеточную структуру, ДНК в клетках было столько, что она прокрашивалась обычными флуоресцентными красителями, как современные образцы. А тут – обугленные кости. Те, кто планировал и осуществлял ликвидацию останков убитых, не могли ничего знать о ДНК, но все же сумели серьезно затруднить работу исследователей. Кости были обожжены и, возможно, облиты серной кислотой, вдобавок имели рыхлую, губчатую структуру. “Худший случай для анализа ДНК, какой можно только придумать”, – вспоминал Е. И. Рогаев.
В итоге отобрали хорошо сохранившиеся участки бедренных костей, которым при нахождении были присвоены номера 146 и 147. Кроме того, для повторного исследования взяли костные фрагменты из первого захоронения, принадлежавшие Николаю II, императрице Александре, Ольге, Татьяне и Анастасии (соответственно 4, 7, 3, 5, 6). Небольшие количества (как правило, сотни миллиграммов) костной ткани тщательно очищали от возможных загрязнений и размалывали в порошок. Верхнюю часть костных фрагментов всегда удаляли, что само по себе было непростой задачей: удалить слишком много – потерять драгоценный материал, удалить мало – рисковать загрязнением.
