Морис Уилкинс, получивший Нобелевскую премию 1962 г. вместе с Уотсоном и Криком, не участвовал в построении модели, но работы по изучению структуры ДНК, в том числе и работа Розалинд Франклин, были начаты во многом благодаря ему. Сама же Франклин не дожила до вручения премии – она умерла от рака в 1958 г. в возрасте 37 лет.
Теперь два абзаца биохимии, чтобы подвести итог достижениям отцов (и матерей) молекулярной биологии. Постарайтесь это пережить, а кому не хочется – просто посмотрите на рис. 4 (справа) и переходите к следующей главе. Молекула пятиатомного углевода дезоксирибозы в составе ДНК замкнута в цикл, к ней присоединены азотистое основание и фосфат. Атомы углерода в дезоксирибозе пронумерованы, от одного до пяти; цифры помечены штрихами (в отличие от углеродов азотистого основания, которые пронумерованы без штрихов). К 5’ – углероду присоединен “собственный” фосфат нуклеотида, к 3’ – углероду – фосфат другого нуклеотида, соседа по цепочке. По ним названы и концы нуклеотидной цепи – 5’ – и 3’ – конец. “Начало” цепи, ее “левый” конец (мы читаем слева направо, и последовательность нуклеотидов в ДНК нам удобнее записывать таким же образом) – это 5’ – конец. Любая цепочка ДНК (или РНК) растет от 5’ – к 3’ – концу – новый нуклеотидный остаток всегда присоединяется к 3’ – атому.
Азотистые основания – это то, благодаря чему четыре нуклеотида различаются между собой (остатки дезоксирибозы и фосфаты у всех нуклеотидов одинаковые). Два больших, аденин и гуанин (см. рис. 4), называются пуринами, а два маленьких, с одним шестичленным циклом – тимин и цитозин – пиримидинами. Это и есть те самые “буквы” А, Т, G, С, которыми записывается генетическая информация. Что существенно – этими нуклеотидами две цепочки двойной спирали держатся друг за друга. Напротив аденина всегда стоит тимин, а напротив гуанина – цитозин. Таким образом, последовательность нуклеотидов в одной цепочке однозначно определяет последовательность нуклеотидов в другой цепочке, что позволяет ДНК копироваться.
Теперь мы знаем, что такое ген!
Следующие десятилетия тоже прошли не зря. Структура молекулы – это прекрасно, однако надо было понять, каким образом ДНК копируется (реплицируется), как записанная в ней информация превращается в признаки.
Наиболее важное и удивительное свойство двойной спирали – это, конечно, заложенная в ее структуре способность к самокопированию. Если разделить две нити, то на каждой можно начать строить ее копию, в итоге получить вместо исходной двойной спирали две одинаковые и по-сестрински разделить их между сестринскими клетками. Или построить на определенном участке ДНК молекулу матричной РНК (мРНК) – инструкцию для синтеза белка. Ура, наконец-то мы узнали, что такое ген – фрагмент ДНК, в котором записана последовательность аминокислот определенного белка, плюс регуляторные участки, через которые происходит включение и выключение гена. (Правда, есть и такие гены, которые кодируют не матричную РНК и через нее белок, а просто РНК, имеющую самостоятельные функции.)
Разобрались с репликацией ДНК, расшифровали генетический код, то есть разгадали, каким образом можно записывать последовательности из 20 аминокислот четырьмя нуклеотидами. Оказалось, природа использует элегантный шифр – каждой аминокислоте соответствуют три нуклеотида; таких комбинаций существует, как нетрудно подсчитать, 64, поэтому одной аминокислоте могут соответствовать несколько триплетов – код вырожденный, как говорят математики.
Стало понятно, что ДНК в ядре клетки – это библиотека, в которой книги не выдают на дом, но позволяют снимать копии и забирать с собой. Или, в современных образах, – магазин электронных книг, который может продать бесконечное количество экземпляров той или иной книги в удобном для чтения формате. Копии книг – это матричные РНК, рибосомы (клеточные машинки для синтеза белка) читают их по триплетам и в соответствии с этими триплетами строят белок. Таким образом, поток информации идет в направлении от ДНК к РНК и затем от РНК к белку. Это и есть центральная догма молекулярной биологии, которую сформулировал Фрэнсис Крик в 1958 г.
Возможно, “догма” не самое подходящее слово. Как писал историк молекулярной биологии Хорас Джадсон в книге “Восьмой день творения” (The Eighth Day of Creation) о своем разговоре с Фрэнсисом Криком: “«Я имел в виду, что догмой называют идею, для которой нет обоснованных подтверждений. Понимаете?!» Крик издал восторженный рев. «Да я просто не знал, что значит «догма»! И мог бы с тем же успехом назвать ее Центральной Гипотезой или как-то в этом роде. Это я и хотел сказать. Догма – только слово-крючок»”. В любом случае сегодня центральная догма “ДНК → РНК → белок” ни у кого не вызывает ни малейших сомнений: обоснованных подтверждений более чем достаточно. Хотя теперь известно, что информация может передаваться от РНК к ДНК (например, в жизненном цикле некоторых вирусов с РНК-геномом), общей картины это не меняет. Магистральный поток информации направлен от ДНК к белкам – строителям и строительным материалам всего живого.
Как читать ДНК
Фредерик Сенгер и его метод секвенирования
Конечно, все захотели читать ДНК – черпать информацию о жизни прямо из источника. Но как читать буквы, если эти буквы – молекулы?
Необходим был удобный метод определения нуклеотидной последовательности, и такие методы стали появляться. Правда, большая часть их сегодня имеет лишь историческую значимость: для нынешних биологов “плюс-минус” секвенирование или “секвенирование по Максаму – Гилберту методом химической деградации” – что-то вроде микроскопа Левенгука.
Слово “секвенирование”, собственно, и означает “определение последовательности” (от англ. sequence); говорят о секвенировании ДНК, РНК, белков. Предложенное в 1970 г. секвенирование по Максаму – Гилберту, если коротко, подразумевало расщепление ДНК в растворах, организованное таким образом, чтобы получались молекулы всех возможных длин. Но это не самый рациональный подход. ДНК – именно та молекула, которая умеет копироваться сама на себе. Если взять у клетки ферменты, которые работают с ДНК, и научиться их использовать в наших целях, можно добиться многого. Почему бы, например, вместо того чтобы нарезать ДНК столькими способами, сколько в ней букв, не нарастить на ней дочерние цепи всех возможных длин? На этой идее основано секвенирование по Сенгеру – метод, также изобретенный в 70-е гг. прошлого века и благополучно доживший до наших дней.
Английский биохимик Фредерик Сенгер (1918–2013) – один из четырех человек, получивших две Нобелевские премии, и единственный, у которого обе – по химии (1958 и 1980 гг.): за определение структуры белка инсулина и за метод секвенирования ДНК. В 1975 г. Сенгер в совместной статье с Аланом Коулсоном представил метод “плюс-минус” секвенирования
[10]. С помощью этого метода группа Сенгера почти полностью прочла геном бактериофага φX174 (5386 нуклеотидов) – по тем временам большой успех
[11]. Однако все эти достижения затмило секвенирование по Сенгеру методом терминаторов, он же метод обрыва цепи, или дидезоксиметод
[12]. Но сначала нужно объяснить, как молекулы ДНК сортируют по размеру с помощью электрофореза.
