Сначала изучили работу регуляторных участков LMI1 и RCO в зачатках листьев сердечника и резуховидки. Чтобы удобнее было регистрировать экспрессию этих генов, к их регуляторным участкам присоединили бактериальный ген, включение которого окрашивает клетки в голубой цвет. Оказалось, что области экспрессии, определяемые регуляторными участками двух генов, сильно различаются. LMI1 экспрессируется на концах будущих вторичных листочков, которые закладываются как небольшие выступы на краю развивающегося листа, а RCO — в основаниях этих выступов (илл. II, см. цветную вклейку). При этом LMI1 экспрессируется также в зачатках цветов и прилистников, тогда как работа RCO приурочена исключительно к основаниям вторичных листочков сложного листа. Области экспрессии LMI1 похожи у разных крестоцветных, включая и упомянутый базальный вид — крылотычинник с простыми листьями.
Таким образом, отличия в регуляторном участке гена RCO, накопленные после дупликации, изменили область его экспрессии по сравнению с исходной (предковой), характерной для LMI1. Это указывает на то, что RCO приобрел новую функцию (произошла неофункционализация).
Затем ученые проверили, влияют ли на новую функцию гена RCO особенности его белок-кодирующей части. Они проделали поистине ювелирную работу, присоединив кодирующую часть LMI1 к регуляторной части RCO и вставив эту конструкцию в геном сердечника с мутацией rco (как мы помним, у сердечника с этой мутацией сложные листья превращаются в простые). В результате простые листья растений-мутантов снова стали сложными. Следовательно, для формирования сложных листьев важны только особенности регуляторной части RCO, а белок-кодирующая часть срабатывает и в старом варианте. Стало быть, белки, кодируемые генами RCO и LMI1, сами по себе остались взаимозаменимыми. Все дело в том, что появились новые области экспрессии (в основаниях выступов листа) вдобавок к старым (на внешнем краю листовой пластинки).
И вот пришло время решающего эксперимента. Если предположения исследователей верны и листья у A. thaliana упростились в связи с потерей гена RCO, то возвращение утраченного гена должно привести к тому, что листья любимого цветочка генетиков усложнятся. Эксперимент был проведен — и дал положительный результат (рис. 16.2).
Правда, листья у трансгенных A. thaliana не стали такими же сложными, как у сердечника C. hirsuta. Вторичные листочки не сформировались, вместо них получились лопасти. По-видимому, чтобы лопасти стали полноценными вторичными листочками с собственными черешками, помимо RCO нужно что-то еще — какие-то дополнительные генетические особенности, имеющиеся у сердечника и отсутствующие у резуховидки. Интересно, что точно такие же лопастные листья, как у трансгенных A. thaliana, характерны для родственного вида A. lyrata, в геноме которого, как мы уже упоминали, сохранился ген RCO.
рис. 16.2. Ген RCO, вставленный в геном Arabidopsis thaliana, превращает простые листья в лопастные. Слева — обычное растение A. thaliana, справа — трансгенное. Длина масштабной линейки — 1 см.
Дальнейшие опыты показали, что различные варианты гена LMI1, взятые у разных представителей крестоцветных (и даже у некоторых других двудольных), вызывают формирование лопастных листьев у A. thaliana, если белок-кодирующие участки этих генов объединить с регуляторным участком RCO. Это еще один довод в пользу того, что ключевое эволюционное новшество при формировании сложных листьев у крестоцветных состояло в изменении регуляторного участка RCO, тогда как свойства белков, кодируемых этими генами, весьма консервативны.
Наконец, ученые попытались выяснить, каким образом ген RCO со своим специфическим регуляторным участком превращает простой лист с волнистым или зазубренным краем в лопастной или перистый. Для этого потребовалось внимательнее приглядеться к тому, что именно делает RCO, как он влияет на развитие листа. Исследователи сравнили рост листовых зачатков у обычного сердечника с перистыми листьями и у мутантов rco с простыми листьями. В обоих случаях на краю листовой пластинки формируются небольшие округлые выступы. Дальнейший рост этих выступов протекает одинаково у обычных C. hirsuta и у мутантов rco. Однако в поведении клеток, расположенных в промежутках между выступами, наблюдаются контрастные различия. В норме у C. hirsuta эти клетки не делятся. Поэтому между растущими выступами формируются глубокие вырезы, а сами выступы в итоге становятся вторичными листочками. У мутантов rco клетки в промежутках между выступами активно делятся, поэтому край листового зачатка растет равномерно. В результате вместо перистого листа получается сплошная листовая пластинка с волнистым краем. По-видимому, это значит, что ген RCO, экспрессирующийся в основаниях выступов, не столько ускоряет рост самих выступов, сколько подавляет деление клеток в промежутках между зонами своей экспрессии.
рис. 16.3. Эволюция формы листа у крестоцветных. Внизу — эволюционное дерево генов LMI1 (темно-серые линии) и RCO (светло-серые). У базальных крестоцветных (Aethionema arabicum) не было гена RCO, а листья были простыми. У общего предка Cardamine и Arabidopsis произошла дупликация гена LMI1 (черный кружок). Одна из двух копий удвоившегося гена сохранила старую функцию, а другая (RCO) приобрела новую благодаря изменениям регуляторного участка, что способствовало усложнению формы листьев. Впоследствии утрата RCO (черный крестик) привела к вторичному упрощению листьев у A. thaliana. Поломка гена RCO у C. hirsuta (мутация rco) ведет к упрощению листьев. Возвращение утраченного гена RCO в геном A. thaliana приводит к усложнению формы листа. По рисунку из Vlad et al., 2014.
Таким образом, детали головоломки постепенно сложились в целостную картину (она схематично изображена на рис. 16.3). У первых крестоцветных, унаследовавших ген LMI1 от своих предков и еще не имевших RCO, листья были простыми, как у крылотычинника (Aethionema). Затем произошла дупликация LMI1 с последующей неофункционализацией одной из копий. Новая функция возникла благодаря изменению регуляторной части гена, что повлияло на область его экспрессии. Ген начал экспрессироваться в основаниях выступов развивающейся листовой пластинки. Это затормозило деление клеток в промежутках между выступами и привело к усложнению формы листа. В дальнейшем предки A. thaliana утратили ген RCO, что вызвало вторичное упрощение листа (как у C. hirsuta с мутацией rco). Однако в геноме A. thaliana сохранились все прочие необходимые компоненты программы развития сложного листа, не хватает лишь гена RCO (или любого похожего гена, управляемого регуляторной областью RCO). Если его искусственно вставить в геном A. thaliana, растение приобретает сложные лопастные листья, в точности как у родственного вида A. lyrata.
