В середине 1990-х гг. Жан-Мари Лен предложил необычный подход к подобным исследованиям: вместо 100 экспериментов при поиске соединений, блокирующих фермент, можно обойтись всего 20 опытами и получить надежный результат, т. е. выяснить, какое соединение из намеченных 100 блокирует фермент наиболее эффективно. Для этого надо использовать не сами ингибиторы, а взять их «предшественников» – реагенты, из которых их синтезируют. Основное требование состоит в том, что «предшественники» должны обратимо реагировать между собой в процессе синтеза ингибитора.
Обратимость очень важна, поскольку такие реакции обладают одним замечательным свойством. Если при проведении этой реакции один из продуктов удаляется из сферы реакции (например, связывается с каким-либо специально введенным реагентом), то система сдвигается в сторону образования именно этого продукта, чтобы восполнить его убыль. Как сказал в свое время древнегреческий философ Аристотель: «Природа не терпит пустоты».
Пример обратимой реакции – синтез иминов – соединений, содержащих группировку – N=CH–, они получаются из аминов и альдегидов, сдвоенная стрелка в схеме показывает, что реакция обратима (рис. 6.14).
Если вы прочли предыдущие главы, то должны мысленно воскликнуть: «Опять эти имины!» Да, это те самые имины, которые помогли получить борромеевы кольца и печать Соломона.
Итак, допустим, что у нас имеется десять аминов, различающихся группой R, и десять альдегидов с различными органическими группами. Из этого набора мы можем получить 100 различных иминов, а далее проверить, насколько эффективно каждый из них связывает фермент. Таким образом, нам потребуется 100 пробирок, в каждую из которых мы поместим по одному имину и будем добавлять туда порции фермента: например, с помощью удобной «многозубой» пипетки, показанной ранее. В результате экономится время и соблюдается нужная точность. Все это называют комбинаторной химией.
Лен предложил поставить эксперимент принципиально иначе – не готовить заранее имины, а смешать в первой пробирке десять аминов и первый из десяти намеченных альдегидов. В реакционной смеси при этом образуются десять иминов, которые будут находиться в равновесии с исходными веществами. Во второй пробирке необходимо смешать все десять аминов и второй альдегид и т. д. Затем в каждой из десяти (по числу альдегидов) пробирок проводят взаимодействие с ферментом и определяют, в какой из полученных смесей фермент заметнее всего потерял активность, т. е. блокировался. Поскольку в каждом опыте присутствует смесь продуктов, органическую группу у азота обобщенно обозначим R*. Показанная на рис. 6.15 схема опытов напоминает поиск наилучшего рыболовного крючка, где роль рыбки играет связывающий фермент.
Таким образом, с помощью 10 опытов можно обнаружить самый эффективный из 10 альдегидов. Обозначим его R#CH=O.
Далее следует найти наиболее результативный амин, для этого проведем взаимодействие найденного нами «лучшего» альдегида с каждым из аминов в отдельности (рис. 6.16).
В итоге мы получим 10 иминов, для каждого проверим силу связывания с ферментом. В результате выясним, какая пара амин – альдегид является оптимальной, для чего нам потребовалось всего 20 опытов.
Повторим кратко: методика поиска нужной пары такова – вначале смесь аминов взаимодействует по очереди с каждым альдегидом, что позволяет найти «лучший» альдегид, а затем его смешивают по очереди с каждым амином и находят «лучший» амин.
Теоретически можно было бы обойтись всего одним опытом: смешать все амины и все альдегиды в одной пробирке, добавить фермент, а затем посмотреть, для какого амина и альдегида более всего снизилась концентрация (они ведь более всего израсходуются на связывание с ферментом). Однако пока даже самые современные сверхчувствительные спектральные методы не позволяют провести точный анализ столь сложной смеси.
Ранее мы сравнили эту процедуру с поиском наилучшего рыболовного крючка, но, пожалуй, более точной будет другая аналогия: берут много заготовок для ключей (набор аминов и альдегидов), из которых получается несколько ключей (иминов). Роль замка играет фермент, который сам находит подходящий ключ. Находясь в равновесной смеси, фермент направляет синтез иминов, отбирая наиболее эффективный ингибитор (рис. 6.17).
Нельзя не оценить смелость и своеобразие подхода, предложенного Леном. В традиционной химии синтетик, планируя взаимодействие соединений, вначале всегда тщательно их очищает, а затем в процессе синтеза старается исключить присутствие посторонних веществ. Взамен этого Лен предложил проводить реакции сразу со смесью веществ.
Поскольку работу с «многозубой» пипеткой называют комбинаторной химией, Лен назвал предложенный им новый подход динамической комбинаторной химией, а набор иминов, возникающих в реакционной смеси, динамической комбинаторной библиотекой. Это несколько необычная библиотека, в ней объекты возникают только в процессе синтеза и представляют собой смесь продуктов реакции. Эффективность нового метода Лену удалось показать при поиске ингибитора для фермента карбоангидразы (это фермент, контролирующий превращения СО2 в организме). При проведении эксперимента Лен взял свыше десяти аминов и альдегидов в качестве исходных соединений. На рисунке 6.18 для простоты показан набор, состоящий всего из трех аминов и трех альдегидов, из них могут быть получены девять иминов. Фермент «сам нашел» в этой смеси наиболее активный ингибитор (в рамке).
Следом за Леном биохимики многих лабораторий стали активно использовать новую химию. Были найдены другие обратимые реакции, пригодные для создания динамических комбинаторных библиотек. Это позволило найти ингибиторы для широкого набора белков, что легло в основу создания новых лекарственных препаратов.
Не только экономия времени и реагентов
На первый взгляд может показаться, что новая методика позволяет всего лишь экономить время, затраченное на эксперимент, и уменьшить расход реагентов (это особенно важно для ферментов, которые часто весьма дефицитны). Однако значение предложенного метода гораздо шире.
В химии часто возникает вопрос, насколько та или иная смесь аминокислот или белков, получаемая на разных стадиях производства различных препаратов, по составу близка к эталонному составу. По методике динамической комбинаторной химии составляют набор из определенных флуоресцентных красителей – органических комплексов металлов, таких, например, как Cu и Ni, затем снимают спектр смеси. После этого к одной порции смеси красителей добавляют эталонную смесь аминокислот (или белков), а к другой – исследуемую. Белки избирательно «выдергивают» ионы металлов из молекул красителей, в результате часть красителей разрушается и спектр смеси меняется. Сравнение спектров (фактически это всего два измерения) позволяет точно оценить, насколько близки по составу смеси, при этом не приходится проводить детальный химический анализ. В этой методике уже нет никаких аминов, альдегидов и иминов, просто использована сама идея динамической комбинаторной химии.
