9 января 1940 года «Щ-320» вышла в район южнее острова Утё (позиция № 6) для смены ПЛ «Щ-319». Как и ее предшественнице, «Щ-320» не повезло — все время нахождения на позиции подводной лодке пришлось бороться со штормами и льдом. На субмарине оборвало антенны, а орудия и надстройка представляли собой бесформенные ледяные глыбы. 20 января подводная лодка получила приказ командования возвращаться на базу, но сделать это было не так просто. В Финском заливе «Щ-320» встретила тяжелые льды. Субмарине пришлось идти в Либаву, куда она прибыла 23 января. На этом участие подводной лодки в этой кампании завершилось.
Начало Великой Отечественной войны «Щ-320» встретила под командованием капитан-лейтенанта (впоследствии капитана 3-го ранга) Вишневского Ивана Макаровича в составе 7-го дивизиона 2-й бригады подводных лодок КБФ в среднем ремонте в доке Таллина. 4 июля подводная лодка прибыла в Ленинград и с 18 августа находилась в готовности к походу.
Вечером 20 сентября «Щ-320» вышла на позицию в северную часть Данцигской бухты (позиция № 4), на перекресток сразу нескольких важных коммуникаций противника. Спустя 56 часов после выхода из Кронштадта «Щ-320» завершила форсирование Финского залива. Через три дня подводная лодка вышла в свою первую торпедную атаку. С дистанции 12 кбт «Щ-320» выпустила одну торпеду по транспорту, идущему без охранения. Спустя две минуты на подводной лодке услышали глухой взрыв. Чтобы убедиться в успехе, командир субмарины через 17 минут после атаки в перископ осмотрел место боя. Был обнаружен второй транспорт в окружении шлюпок и катеров. Противник не комментирует результат этой атаки (55°05′ с.ш./19°37′5″ в.д.). Советская сторона заявляет об уничтожении транспорта «Холланд» (реально на момент гибели «Марианн») в 911 брт., которое погибло в этот день на германской мине в районе Кольберга. Во время атаки на подводной лодке отказали предохранители электросети кормовых горизонтальных рулей, носовые рули также заклинило. Субмарина стала погружаться с дифферентом 45°, был пролит электролит, гирокомпас вышел из меридиана.
Продолжая поход, подводная лодка еще дважды выходила в атаку (1 и 13 октября) по одиночным транспортам. В обоих случаях взрывов не последовало. Противник и эти атаки оставляет без комментариев. Первый поход «Щ-320» сопровождал инцидент, связанный с нарушением радиосвязи. Переданное с подводной лодки днем 6 октября третье донесение стало первым, которое приняли в штабе флота. По официальным данным, командир БЧ-1-4 лейтенант Трубицын не передал радистам подводной лодки новые радиоданные, и практически на протяжении всего похода «Щ-320» выходила в эфир не на той частоте, на которой ей предписывалось. В результате командование, посчитав «Щ-320» погибшей при форсировании Финского залива, на две недели задержало развертывание на позициях других подводных лодок. Принимая во внимание, что такая же история случилась с «Щ-319», вышедшей одновременно с «Щ-320», то можно полагать, что вина в происшедшем лежит на флагманских связистах.
Утром 25 октября «Щ-320» благополучно вернулась в Кронштадт и сразу же перешла в Ленинград для ремонта.
Экипаж субмарины считался одним из самых боеготовых в бригаде ПЛ Балтийского флота, поэтому кампанию 1942 года «Щ-320» начала в составе подводных лодок первого эшелона, выходивших на коммуникации противника. Уже в ночь на 14 июня «Щ-320» пришла на Лавенсари. На переходе подводная лодка подверглась атаке 3 самолетов противника, так как в нарушение указаний командования субмарина осуществляла переход в надводном положении. От близких разрывов бомб «Щ-320» получила незначительные повреждения приборов и механизмов. Вырубились предохранители центральной распределительной станции, вышли из строя вертикальный руль и гирокомпас. Для исправления повреждений подводной лодке пришлось некоторое время пролежать на грунте. В этот же день субмарина вышла на позицию в район Мемель — Либава (позиция № 8).
Днем 16 июня на рейде острова Макилуото восточнее маяка Порккалан-Каллбода подводная лодка обнаружила группу судов противника, стоящих на якоре. Для выхода в атаку ей предстояло сложное маневрирование по извилистому фарватеру между камнями. С дистанции 12 кбт субмарина выпустила по одному из транспортов две торпеды и через 1,5 минуты услышала взрыв. Подняв перископ, командир «Щ-320» увидел тонущий транспорт. На самом деле одна из выпущенных торпед взорвалась, не дойдя до цели, ударившись о подводные камни, а плавбазе катеров-тральщиков «MRS-12» (бывший пароход «Нюрнберг» в 5635 брт.) повезло дважды, так как 15 июня ее уже атаковала «Щ-304».
Спустя час противник обнаружил подводную лодку и начал охоту, сбросив 24 глубинных бомбы. Почти трое суток субмарина не могла как следует произвести зарядку батарей, уходя от преследования то самолетов, то катеров. По этой причине субмарина задержалась в Финском заливе на двое суток. Наконец, форсирование Финского залива было завершено, и ночью 21 июня «Щ-320» прибыла на позицию.
Днем 5 июля в районе косы Курише-Нерунг (Куршская коса) «Щ-320» произвела атаку конвоя. Торпеда попала в танкер «Анна Катрин Фритцен» в 677 брт., и он пошел ко дну. Четыре часа германские корабли 3-й флотилии СКР безуспешно сбрасывали глубинные бомбы в месте предполагаемого нахождения «Щ-320». Подводная лодка ушла, не получив повреждений.
Днем 16 июля у мыса Акменрагс подводная лодка попыталась увеличить счет, выпустив с дистанции 10 кбт две торпеды по германскому судну «Гудрун». Транспорт заметил следы торпед и увернулся. Торпеды взорвались на мелководье, а командир «Щ-320», осмотревшись в перископ, увидел тонущий транспорт. Противник сбросил на безопасном расстоянии от подводной лодки 8 глубинных бомб.
17 и 18 июля подводная лодка отходила к Готланду для перезарядки торпедных аппаратов и доливки дистиллированной воды в аккумуляторы, а на следующий день «Щ-320» вышла на коммуникации противника Мемель — Брюстерорт. К 20 июля на «Щ-320» начали подходить к концу запасы продовольствия и топлива, и ей пришлось возвращаться на базу. 24 июля подводная лодка приступила к форсированию Финского залива и днем 27 июля самостоятельно вошла на рейд Лавенсари.
По итогам похода на счет «Щ-320» было засчитано потопление трех транспортов противника (6000 тонн и два по 8000 тонн). Весь экипаж подводной лодки был отмечен орденами и медалями. Командир «Щ-320» И. М. Вишневский награжден орденом Ленина. 23 октября 1942 года Указом Президиума Верховного Совета СССР подводная лодка «Щ-320» была награждена орденом Красного Знамени.
О том, что их корабль стал Краснознаменным, ни командир, ни экипаж подводной лодки так и не узнали. 1 октября 1942 года «Щ-320» вышла на позицию в район к западу от острова Борнхольм (позиция № 1). В течение похода «Щ-320» на связь так и не вышла, и дальнейшая ее судьба неизвестна. Предположительно, подводная лодка погибла 3-10 октября 1942 года на мине. Некоторые источники указывают, что «Щ-320» подорвалась на плавающей мине в районе зарядки аккумуляторов к северо-западу от острова Вайндло 3 октября 1942 года. Возможно, что субмарину потопили германские корабли ПЛО вечером 3 октября у острова Гогланд (вышедшая одновременно с «Щ-320» подводная лодка «Щ-303» слышала в этом направлении взрывы глубинных бомб). Иногда указывается, что подводная лодка стала жертвой торпеды финской подводной лодки «Ику Турсо» в районе о-ва Утё 27 октября 1942 года, что не соответствует действительности. На «Щ-320» погибло 37 человек.
