Основываясь на предположении, что обонятельные рецепторы относятся к обширному семейству рецепторов, сопряженных с G-белками, Бак подобрала пробы, которые позволили бы обнаружить любые ранее неизвестные рецепторы этого семейства в обонятельном эпителии крысы. С помощью обрезающих ферментов она урезала полученные последовательности генов и запечатлела на биохимическом геле ряд маркеров-полосок, которые доказывали наличие в обонятельном эпителии нового и крайне обширного подсемейства генов GPCR.
Рассказывая эту историю, Бак признается, что поначалу просто не поверила своим глазам, а потому убрала полученные маркеры и ушла домой. На следующее утро она осознала, что результаты очень даже реальны, и показала их Акселю, который пришел в полный восторг от увиденного. В 1991 году в своем докладе они назвали долгожданное открытие генами ольфакторных (обонятельных) рецепторов, ведь именно они несли в себе код, позволяющий клеткам запускать программу производства белков обонятельных рецепторов. Ученые предположили, что в новом подсемействе может обнаружиться до тысячи новых генов.
Открытие генов ольфакторных рецепторов не только позволило разгадать загадку обонятельных рецепторов, но и распахнуло перед человечеством дверь в новую эру исследования механизмов восприятия запахов. За их вклад в развитие науки и открытие, считающееся одним из величайших прорывов в биологии, в 2004 году Бак и Акселю присудили Нобелевскую премию по медицине.
КОНЦЕПЦИЯ БЕЛКОВОГО «КАРМАНА» ДЛЯ ЗАПАХА
Каким же образом эти рецепторы вписываются в нашу аналогию «ключ-замок»? Несколько лет тому назад мы (и другие ученые) начали думать над этим вопросом. Мы выдвинули гипотезу, что взаимодействие одорированной молекулы и рецептора происходит не в узком «замке», к которому подходит лишь один ключ, а в более объемном пространстве, так называемом «кармане» (или «лунке») связующего белка, по аналогии со структурами, имеющимися у многих других рецепторов, участвующих в передаче сигналов на молекулярном уровне. Мы также предположили, что одна рецепторная клетка может иметь только один вид рецептора, а следовательно, рецептор этот не узкоспециализированный, как рецепторы нейромедиаторов, а обладает широким спектром аффинности
[37], совпадающей известными реакциями обонятельных рецепторных клеток на разные раздражители. Привлекательность этой гипотезы в том, что обонятельные рецепторы в ней схожи с фоторецепторами сетчатки глаза, каждый из которых обладает лишь одним видом цветовых рецепторов из трех возможных, но при этом способен воспринимать световое излучение с разной длиной волн.
Концепция «одна клетка – один рецептор» была экспериментально подтверждена в лаборатории Ричарда Акселя и при исследованиях отдельных клеток крыс в лаборатории Линды Бак, а впоследствии – в Гарвардском университете и в энтомологических исследованиях Джона Карлсона в Йельском университете.
Это изменило проблематику изучения рецепторов. Теперь нужно было найти эти связующие «карманы», аналогичные тем, что есть у других рецепторов-медиаторов и фоторецепторов, но при этом способные по-разному взаимодействовать с разными молекулами запаха. Получается, что классическая схема «ключ-замок», уместная для описания работы ферментов и других рецепторов, в случае обонятельных рецепторов не подходит, ведь, согласно гипотезе, они обладают уникальным механизмом широкой аффинности. Это прекрасный пример новой концепции рецепторной активности с расширенным спектром взаимодействий.
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МОЛЕКУЛ ЗАПАХА И ОБОНЯТЕЛЬНЫХ РЕЦЕПТОРОВ
Стандартным методом исследований сигнальных молекул рецепторов в фармацевтической индустрии является «экспрессия» – профессиональный жаргонизм, означающий, что рецептор заставляют проявиться в клетке-носителе, а затем испытывают на нем различные типы сигнальных молекул и препараты, которые потенциально могут блокировать или усилить передачу сигнала. Благодаря генной инженерии любую аминокислоту в генетической цепочке рецептора можно заменить на другую, в ходе чего ученые могут установить, какие аминокислоты жизненно необходимы для функционирования рецептора, а также узнать, какие из них распознаются определенными белковыми комплексами сигнальных молекул.
Современные генные инженеры могут заменить любую аминокислоту в ДНК обонятельного рецептора на другую, чтобы опытным путем узнать, какие из них за что отвечают.
К сожалению, обонятельные рецепторы с трудом поддавались экспериментальной экспрессии в клетках-носителях. Решение этой проблемы в 1998 году нашли один из моих бывших студентов Стюарт Файрстайн, его аспирант Хайсин Жао и их коллеги-ученые из Йельского и Колумбийского университетов. Они исхитрились и прикрепили один из рецепторных генов к вирусу, а потом подсадили его к рецепторным клеткам в носу крысы. Это позволило вирусу заразить все рецепторные клетки, заставляя их «экспрессировать» содержащийся в вирусе рецепторный ген OR-I7. Затем ученые смогли зафиксировать данные от всех рецепторных клеток и узнать, какие молекулы запаха их активируют. Было установлено, что примерно из двухсот опробованных ими молекул запаха рецепторы отдавали предпочтение алифатическим (линейным) альдегидам с цепочкой из восьми атомов углерода (C8, то есть октаналь, октиловый или каприловый альдегид), при этом реакция на боковые группы снижалась при длине цепочек от C6 до C10.
Получалось, что связующий «карман» обладает избирательностью по как минимум двум параметрам: терминальной функциональной группе и длине цепи. Чтобы проверить эту гипотезу, Майкл Сингер, студент Йельского университета и аспирант нашей лаборатории, провел дополнительное исследование. Предпринятый в 2000 году компьютерный анализ модели рецептора OR-I7 показал, что при проведении автоматического докинга вслепую октаналь в связующем «кармане» взаимодействует так, как и предполагалось. Это исследование позволило выделить четыре вида стимулирующих характеристик молекул запаха: функциональная группа, длина цепи, размер молекулы и ее форма.
Самым важным открытием этого компьютерного анализа стало понимание истинного охвата связей рецептора OR-I7. Результаты оказались практически идентичными: при моделировании сохранилось соотношение приоритетности октаналя над боковыми группами альдегидов. В то же время в лаборатории Файрстайна было проведено другое исследование, показавшее, что при взаимодействии с рецептором OR-I7 молекулы запаха, являясь изомерами, крепко связываются с рецептором со стороны «головы» и образуют более свободную связь со стороны «хвоста» цепочек. Предположительно, именно благодаря этой особенности связей рецептор OR-I7 и формирует градацию предпочтительных молекул запаха.
Совокупность экспериментальных и полученных в результате компьютерного моделирования данных подтверждает гипотезу о том, что детерминанты (определители) запаха взаимодействуют со связующим «карманом» обонятельных рецепторов аналогично тому, как это происходит у других рецепторов, сопряженных с G-белками. При этом у молекул запаха есть целый набор сайтов-детерминантов для связи с разными видами рецепторов, что позволяет обонятельным рецепторам избирательно взаимодействовать с детерминантами различных молекул.
