Имея разрешение выше 3,5 ангстрем, можно определить атомную структуру, поскольку на данном уровне начинают просматриваться характерные черты аминокислот и оснований. Аминокислоты, входящие в состав белков, отличаются по форме: бывают большие и плоские, длинные и тонкие или обрубленные. Если знать порядок, в котором они должны идти, можно составить белковую цепочку, ориентируясь на контуры аминокислот, словно вы собираете большой трехмерный пазл. Аналогично, в ДНК и РНК, основания Т (U) и С – маленькие, а основания А и G – большие. Химическую структуру молекул на таких картах можно воссоздать с точностью до атомов, но при сборке возможны ошибки, поскольку у нас нет правильного ответа – полной картины, которую размещают на коробочке с пазлом.
Итак, есть пороговое значение примерно в 3,5 ангстрем. Если добиться более высокого разрешения, вы, вероятно, сможете разгадать атомную структуру, а при разрешении ниже 4 ангстрем это будет непросто, если только вы уже не представляете в общих чертах, как именно выглядит молекула.
Первые кристаллы рибосом были ужасного качества и практически не давали дифракционных пятен. Но Аду Йонат это не смущало. Вместе со своим давним коллегой Франсуа Франчески, который курировал опыты по кристаллизации в Берлинском институте, она настойчиво продолжала синтезировать все более качественные кристаллы. Кроме того, Ада вела исследования у себя в лаборатории в Институте Вейцманна в Израиле. На тот момент израильские ученые открывали новые виды животных, чтобы точнее охарактеризовать локальное биоразнообразие. В частности, они обнаружили микроорганизм под названием Haloarcula marismortuii. Эта бактерия существует в суровых условиях экстремально соленого Мертвого моря, то есть является экстремофилом. Позже выяснилось, что Haloarcula – не бактерия, а архея и по сложности рибосом занимает промежуточное положение между бактериями и эукариотами. Ада подумала, что стоит кристаллизовать рибосомы этого организма. Большие субъединицы из них действительно кристаллизовались качественнее, чем какие-либо другие, но их атомную структуру Ада смогла разгадать только после многократного регулирования условий выращивания кристаллов.
Вместе с тем существовала проблема снятия данных. Как правило, кристалл вращают, подставляя его под пучок рентгеновских лучей, чтобы сделать серию снимков и измерить рассеянные рентгеновские лучи в детекторе. При любой ориентации кристалла некоторые его плоскости будут удовлетворять закону Брэгга и давать дифракционные пятна в определенных направлениях. Собрав все возможные пятна, вы получите данные для вычисления структуры кристалла.
Работать с кристаллами рибосом было особенно сложно, поскольку дифракционные пятна от них были слабыми. Дело в том, что выраженность пятен зависит от количества молекул (пятно – результат общего вклада лучей, рассеянных от молекул), каковых в рибосомах больше, чем в типичных белках. Чтобы рассмотреть кристалл целиком, требовалось надолго подставить его под интенсивный пучок рентгеновских лучей, вызывающий в молекулах изменения их внутренней структуры и позиции, а также впускающий в структуру свободные радикалы. След рентгеновского луча на крупном кристалле имеет особый оттенок, дифракционные пятна под большим углом тускнеют и исчезают, пока идет облучение.
Кристаллографы говорят, что кристалл «погибает» в рентгеновских лучах. При работе с маленькими белковыми молекулами можно собрать достаточную информацию с одного кристалла, либо, если он стал «погибать», переходить к новым кристаллам, пока все интересующие данные не будут собраны. В случае с кристаллом рибосомы не удается собрать воедино даже первую дифракционную картину: еще до завершения подготовки первого снимка некоторые пятна уже могут исчезнуть.
Наконец ученые догадались, что, если охлаждать кристаллы, то удастся замедлить диффузию свободных радикалов, возникающих под действием рентгеновских лучей, и снизить ущерб. Первые реальные доказательства о работоспособности такого механизма дали Дэвид Хаас, на тот момент – постдок в Институте Вейцманна в Израиле, и Майкл Россманн из Университета Пердью. Как и многие представители своего поколения, Россманн начал карьеру в LMB, работая у Макса Перуца над изучением первых структур гемоглобина. Сегодня он светило науки. Ему уже за восемьдесят, но он успешно руководит группой и ведет столь активный образ жизни, что, говорят, до сих пор поднимается в горы быстрее своих пост-доков и студентов. Хаас и Россманн решили остудить кристаллы фермента до –75 °C и обратили внимание, что дифракционные пятна от них стали исчезать значительно медленнее. Но кристаллы, наполовину состоящие из воды и выглядящие правильными, на деле оказываются дряблыми, как медуза, или рассыпчатыми, как сыр. Белковые молекулы имеют неправильную форму, между ними мало точек соприкосновения и много водных «проток», которые при сильной заморозке превращаются в лед и распирают кристалл. Грег Пецко, на тот момент работавший в MIT, заменил водный раствор в кристаллах своеобразным антифризом.
По каким-то причинам эти методы еще долго не могли закрепиться – возможно, потому, что плохо поддавались обобщению. Первыми на них обратили внимание специалисты по электронной микроскопии, чьи препараты также подвергались электронному облучению. Жак Дюбоше, работавший в Европейской молекулярно-биологической лаборатории (EMBL) в Гейдельберге, обнаружил, что, если быстро бросать образцы в жидкий этан, вода не успевает превращаться в лед. Она витрифицировалась (становилась похожей на стекло), сохраняя биомолекулы в естественном состоянии.
Тем временем норвежец Хокон Хоп, работавший в Калифорнийском университете в Дэвисе, занимался сбором данных на материале нескольких мелких органических молекул, легко окислявшихся при комнатной температуре.
Вероятно по примеру Дюбоше, он догадался остудить кристаллы в масле и быстро кидать их в жидкий пропан. Как он и надеялся, структура кристаллов сохранялась. Хотя теперь этот процесс именуют «замораживанием», а кристаллы называют «замороженными», важно помнить, что данный метод является действенным именно потому, что вода не замерзает, а витрифицируется.
Рис. 7.2. Джоэл Суссман, Феликс Фролов и Хокон Хоп проводят один из первых экспериментов по охлаждению кристаллов в Институте Вейцманна (публикуется с разрешения Джоэла Суссмана)
Хокон побывал в Институте Вейцманна в Израиле и там познакомился с Джоэлом Суссманом, который поинтересовался, может ли Хоп приспособить свой метод для работы с биомолекулами. Хокон вернулся домой и применил свой подход к двум очень мелким белкам. Затем он вновь отправился в Институт Вейцманна и стал работать вместе с Джоэлом и его коллегой Феликсом Фроловым, стараясь сделать этот метод универсальнее. Среди первых кристаллов, с которыми они попытались работать, был кристалл ДНК, исследованием которого занимался студент Джоэла, Леемор Джошуа-Тор. После первых успехов они успешно применили это на нескольких других проектах.
Ада, работавшая в Германии, время от времени возвращалась в свою лабораторию в Институте Вейцманна. В какой-то момент Хокон и другие сотрудники из лаборатории Джоэла убедили Аду попробовать метод охлаждения, чтобы облегчить ей сбор данных о кристаллах рибосом. Поначалу она отнеслась к этому скептически, поскольку для работы с рибосомами требовалось интенсивное рентгеновское излучение из синхротрона, на приборах которого в те времена было нестандартное охлаждающее оборудование. В конце концов Аде и Хокону выделили немного времени, чтобы они могли собрать данные в Стэнфордском синхротронном радиационном центре, расположенном всего в паре часов пути от лаборатории Хокона в Дэвисе. Хокон сложил охлаждающее оборудование себе в машину, поехал в Стэнфорд и сам там все установил. По его свидетельству, первый эксперимент по замораживанию прошел весьма хорошо, ему удалось увидеть красивый дифракционный узор со множеством пятен. Следующие десять с лишним попыток провалились, но он не отступался, пока, наконец, не добился надежного протекания эксперимента. Как только этот метод сработал с кристаллами рибосом, Ада стала пропагандировать такой подход, названный криокристаллографией.
