Сначала Бил взялся за проект в рамках ротации, положенной аспирантам-первокурсникам, и за короткое время умудрился получить кристаллы S15 небольшого рибосомного белка. К концу года ему требовалось решить, где он собирается ближайшие несколько лет готовиться к защите кандидатской диссертации. На тот момент моя полупустая лаборатория вряд ли могла соперничать по привлекательности с расположенными прямо по соседству процветающими лабораториями Уэса Сундквиста и Криса Хилла. Однако у него уже был рабочий проект S15, и благодаря этому мне удалось уболтать его остаться.
Я сказал, что у меня он может продолжить работу над этим белком, но на самом деле я нацеливаюсь на субъединицу 30S. Думал, что он отнесется к этому скептически, особенно когда узнает, что большая и хорошо финансируемая группа Ады в Германии много лет не может взломать ее структуру. Меня приятно удивило, что он загорелся этой идеей. Я предложил ему для начала взяться за пару мелких белков, чтобы он освоил основы расшифровки структур. В последующие годы энергия и оптимизм Била, а также его готовность пробовать новые и нестандартные подходы оказались бесценными.
Следующим ко мне присоединился Брайан Уимберли. Он обращался ко мне с просьбой о работе еще в Брукхейвене, но я переезжал в Юту, и поэтому он связался со мной год спустя. Диссертацию он защитил в Университете Беркли под руководством Игнасио (Начо) Тиноко, где пользовался нетипичным методом ЯМР (ядерно-магнитный резонанс), чтобы показать структуру фрагмента РНК в рибосоме. Работая в постдокторантуре в Исследовательском институте Скриппса в Ла-Хойе, он занимался изучением белков, связывающихся с кальцием, но его интерес к РНК не пропал. К концу пост-докторантуры ему пришлось выбирать между штатной преподавательской должностью в Технологическом институте штата Джорджия и повторной постдокторантурой по изучению кристаллографии. Я был рад пригласить к себе Брайана, имевшего реальный опыт работы с РНК, – сам я знал о РНК сравнительно немного, несмотря на то, что из нее на две трети состоит рибосома.
Мы сразу сработались. Я рассказывал ему, какое отличное и безопасное место город Солт-Лейк-Сити, но когда на следующее утро мы вышли на улицу, то обнаружили побитые стекла на машинах. Я заволновался, что Брайан захочет уехать, но, к счастью, Вера пригласила его на прогулку в холмы вокруг Солт-Лейк-Сити, где они прекрасным весенним утром смотрели на красоты дикой природы. Брайану нравились пешие прогулки и отдых на свежем воздухе, поэтому вопрос о переезде для него был решен.
Затем присоединиться к моему коллективу захотел Джон Маккатчен – смышленый, дерзкий и амбициозный студент из Висконсина. Я думал, что он мог бы начать работать вместе с Брайаном над кристаллизацией рибосомного белка, связывающегося с небольшим, четко определенным фрагментом РНК, но он вскоре счел эту работу слишком простой и быстро решил хоть костьми лечь, но потрудиться над расшифровкой 30S. Определенно, тот факт, что ни Бил, ни Джон особо не разбирались ни в кристаллографии, ни в рибосомах, только помог мне убедить их, что это отличный диссертационный проект.
Рис. 9.1. Лаборатория автора в Юте. На снимке: автор, Джоанна Мэй, Боб Датнолл, Брайан Уимберли, Джон Маккатчен и Бил Клемонс (публикуется с разрешения Исао Танаки)
Проблема была в том, с чего начать. Кристаллы субъединицы 30S, о получении которых впервые сообщила советская группа Гарбер, были взяты от Thermus Thermophilus. Но с момента их получения минуло почти десять лет, и по-прежнему не удавалось добиться достаточно хорошей дифракции, чтобы рассмотреть их атомную структуру.
Размышляя о том, как можно доработать эти кристаллы, я вспомнил лекцию Иоахима Франка, прочитанную в Виктории. Он не только показал изображения целой рибосомы с тРНК, но и продемонстрировал, что контуры субъединицы 30S, рассмотренные в составе рибосомы и отдельно, слегка отличаются. Напрашивался вывод, что ее молекулы гибкие. Субъединицу описывали в антропоморфном ключе; говорили, что у нее есть «головка», соединенная с основной частью, «телом», тонкой «шейкой». Причем отличия наблюдались именно в «головке» – она как будто колыхалась. Такая подвижность головки критически важна для того, чтобы тРНК могли передвигаться по рибосоме. Но гибкость – проблема для кристаллографии, ведь необходимо, чтобы все молекулы укладывались в кристаллической решетке одинаково. Возможно, думал я, чтобы синтезировать качественные кристаллы субъединицы 30S, надо как-то зафиксировать головку.
В рибосоме есть белок, помогающий ей начать движение по мРНК с нужной позиции, который называется фактором инициации 3 или IF3. Он должен прикрепляться между головкой и телом молекулы. В мой последний год в Брукхейвене мы как раз расшифровали его структуру, поэтому именно о нем я и думал. Я предложил Джону Маккатчену заблокировать субъединицу 30S, прикрепив к ней IF3, а затем попробовать ее кристаллизовать.
Мы с помощью Боба Датнолла на хроматографической колонке очистили субъединицы 30S, в частности от ферментов-рибонуклеаз и протеаз, которые могли повредить рибосому, разлагая ее РНК или белок. Это было важно по двум причинам: в таком состоянии субъединицы 30S могли неделями покоиться в капельках, причем в процессе удалялся рибосомный белок S1, связанный с рибосомой слабее, чем остальные белки. В результате у нас получались очень чистые образцы 30S.
Сначала мы решили проверить (опираясь на имеющиеся знания), достаточно ли хороши субъединицы, чтобы вообще кристаллизоваться. Мы стали добавлять белки, чьи структуры уже были расшифрованы, и постепенно выстроили модель субъединицы из кусочков. За пару месяцев мы воспроизвели исходные кристаллы советской группы. Сначала они получились мелкими, а некоторые первичные тесты показали, что при дифракции они дают картинку с очень низким разрешением, хуже, чем самые качественные образцы, полученные к тому моменту. Но постепенно кристаллы становились крупнее.
Как раз в то время нас со Стивом Уайтом пригласили в Швецию на собрание по структурным аспектам синтеза белков – то есть по структурам всех веществ, связанных с рибосомами. Организатор конференции Андерс Лильяс сотрудничал с Марией Гарбер, изучая структуры отдельных рибосомных белков, и они были дружественными соперниками нам со Стивом. Хотя работа мне уже наскучила, выдавалась возможность съездить туда и посмотреть, что происходит. На мероприятии ожидалась не только Ада, но и Питер, так что я мог взглянуть, на каком этапе сейчас находится соперничество. Была и другая причина поехать туда: я мог снова побывать в LMB в Англии по пути в Швецию. Это был не ностальгический визит вежливости – я хотел проверить, удастся ли там поработать.
В то время я чувствовал вдохновение и страх. Что будет, если придется потратить целые годы или мои идеи не сработают? Исследования на базе университета зависят от грантов, а грант действителен всего несколько лет, после чего его необходимо обновлять.
Как правило, такие гранты финансируются NIH после рецензии совета из десяти или более экспертов в определенной дисциплине. Теоретически это отличный способ обеспечения науки, и до сих пор он работает исключительно хорошо. Один ученый сравнил эту систему с рестораном: вы же не хотите зайти на кухню и посмотреть, как готовятся блюда. С такими экспертными советами есть две проблемы. Во-первых, они слишком консервативны и с трудом поддерживают смелые оригинальные предложения, отдавая предпочтения пошаговым проектам, работа над которыми представляется осуществимой. Было бы неплохо организовать такой совет, как суд присяжных: пригласить туда обладателей грантов. Другая проблема такова: каждый экспертный совет получает более тысячи предложений, по пятьдесят страниц каждое. Практика показывает, что внимательно их прочитывают лишь два представителя совета (так называемые первичный и вторичный рецензенты). Достаточно одному из рецензентов высказаться о предложении без энтузиазма – и оно, в сущности, обречено. Однажды, когда я попытался возразить первичному и вторичному рецензентам и спасти предложение, все остальные просто выставили ему среднюю оценку, то есть все равно отклонили его. Поэтому хотя на бумаге этот процесс и кажется честным, на практике он бывает произволен.
