Чтобы отличать две разделенные в пространстве функции метаботропных рецепторов, Сазерленд назвал химический посредник, который связывается с рецептором на наружной стороне клеточной мембраны, первичным, а циклический АМФ, вырабатываемый внутри клетки для передачи сигнала, вторичным. Сазерленд доказывал, что вторичный посредник передает внутрь клетки сигнал, поступающий от первичного, на мембрану и вызывает реакцию на этот сигнал по всей клетке (рис. 16–2). Представление о вторичных посредниках заставило нас предположить, что метаботропные рецепторы и циклический АМФ могут оказаться теми неуловимыми факторами, которые обеспечивают связь медленного синаптического потенциала сенсорных нейронов с усиленным выделением глутамата, тем самым обеспечивая работу кратковременной памяти.
16–2. Два типа рецепторов, выделенных Сазерлендом. Ионотропные рецепторы (слева) вызывают изменения, которые длятся миллисекунды. Метаботропные рецепторы (например, рецепторы серотонина) действуют через вторичных посредников (справа). Они вызывают изменения, которые длятся секунды или минуты и передаются по всей клетке.
В 1968 году Эдвин Кребс из Вашингтонского университета получил первые данные о том, как циклический АМФ производит свое широкое действие. Циклический АМФ связывается с ферментом, который Кребс назвал АМФ-зависимой протеинкиназой или протеинкиназой А (потому что это была первая известная протеинкиназа). Киназы видоизменяют белки, присоединяя к ним молекулу фосфата; этот процесс называют фосфорилированием. Фосфорилирование активирует одни белки, но инактивирует другие. Кребс обнаружил, что фосфорилирование вполне обратимо и может служить простым молекулярным переключателем, включая и выключая биохимическую активность белка.
Затем Кребс стал разбираться с тем, как работает этот молекулярный переключатель. Он открыл, что протеинкиназа А представляет собой сложную молекулу, состоящую из четырех единиц — двух регуляторных и двух каталитических. Каталитические единицы устроены так, что могут осуществлять фосфорилирование, но регуляторные обычно «сидят» на них, подавляя их работу. У регуляторных единиц имеются участки, которые связывают циклический АМФ. Когда концентрация циклического АМФ в клетке увеличивается, регуляторные единицы протеинкиназы А связывают избыточные молекулы. Это приводит к изменению их формы, вызывая отпадение от каталитических единиц, которые получают возможность фосфорилировать белки-мишени.
Представление об этом помогло нам задаться ключевым вопросом, специфичен ли открытый Сазерлендом и Кребсом механизм для действия гормонов на жировые и мышечные клетки или он может включать и иных посредников, таких как нейромедиаторы нервной системы. Если так, то это будет пример ранее неизвестного механизма синаптической передачи.
Здесь нам помогли работы Пола Грингарда — одаренного биохимика, получившего также физиологическое образование, который недавно перешел в Йельский университет с должности директора отделения биохимии исследовательских лабораторий фармацевтической компании Geigy. По дороге в Йель он задержался на год на отделении Сазерленда. Осознав важность возможного нового механизма передачи сигналов в нервной системе, в 1970 году Грингард начал разбираться с метаботропными рецепторами в мозгу крысы. Тут произошло одно замечательное совпадение, связавшее Арвида Карлссона, Пола Грингарда и меня на нашем научном пути, который в 2000 году привел нас троих в Стокгольм, где мы разделили Нобелевскую премию по физиологии и медицине за исследование передачи сигналов в нервной системе.
В 1958 году Арвид Карлссон, великий шведский фармаколог, открыл, что дофамин играет в нервной системе роль медиатора. Затем он показал, что, когда в организме кролика снижается концентрация дофамина, у животного развиваются симптомы, напоминающие болезнь Паркинсона. Когда Грингард стал изучать метаботропные рецепторы головного мозга, он начал с рецептора дофамина и обнаружил, что этот рецептор включает фермент, который увеличивает содержание циклического АМФ и активирует протеинкиназу А в мозгу!
Пойдя по их стопам, мы с Джимми Шварцем открыли, что серотонин в ходе сенсибилизации тоже запускает работу циклического АМФ как вторичного посредника. Как мы уже убедились, удар током по задней части тела аплизии вызывает активацию модуляторных иитернейронов, которые выделяют серотонин. Серотонин, в свою очередь, на несколько минут увеличивает синтез циклического АМФ в пресинаптических окончаниях сенсорных нейронов (рис. 16–3). Итак, все сходилось: концентрация циклического АМФ остается повышенной примерно столько же, сколько длятся медленный синаптический потенциал, повышение синаптической силы связи сенсорных нейронов с мотонейронами и усиленная поведенческая реакция животного, вызванная электрическим ударом по его телу.
16–3. Этапы работы биохимического механизма долгосрочной памяти. Электрический удар по задней части тела аплизии вызывает активацию иитернейрона, который выделяет в синаптическую щель химический посредник серотонин. Преодолев синаптическую щель, серотонин связывается с рецептором на мембране сенсорного нейрона, запуская синтез циклического АМФ (1). Циклический АМФ вызывает отделение каталитической единицы протеинкиназы А (2). Каталитическая единица протеинкиназы А усиливает выделение нейромедиатора глутамата (3).
Первое прямое подтверждение того, что циклический АМФ задействован в формировании кратковременной памяти, было получено в 1976 году, после того как в нашу лабораторию пришел постдок из Италии Марчелло Брунелли. Брунелли осуществил проверку того, что повышение концентрации циклического АМФ в сенсорных нейронах, сигналом для которого служит серотонин, приводит к увеличению количества глутамата, выделяемого из окончаний этих нейронов. Мы вводили циклический АМФ непосредственно в сенсорный нейрон аплизии и обнаружили, что это вызывало резкое повышение количества выделяемого глутамата, а следовательно, и силу синаптической связи сенсорного нейрона с мотонейронами. Более того, введение в клетку циклического АМФ вызывало такое же повышение синаптической силы, как при воздействии серотонином на сенсорные нейроны или при воздействии током на заднюю часть тела животного. Этот замечательный эксперимент не только показал роль циклического АМФ в кратковременной памяти, но и дал нам первые сведения о молекулярных механизмах обучения. Теперь, когда мы научились улавливать основные молекулярные компоненты кратковременной памяти, мы могли использовать их для искусственной имитации формирования памяти.
В 1978 году мы с Джимми начали сотрудничать с Грингардом. Нам хотелось узнать, действует ли циклический АМФ на кратковременную память посредством протеинкиназы А. Мы разделили этот белок на составляющие и ввели непосредственно в сенсорный нейрон только каталитическую единицу, которая в норме и осуществляет фосфорилироеание. Выяснилось, что эта единица делает то же, что циклический АМФ: усиливает синаптическую связь, увеличивая выделение глутамата. Затем, чтобы лишний раз убедиться, что мы на верном пути, мы ввели в сенсорный нейрон ингибитор протеинкиназы А и обнаружили, что он действительно препятствует увеличению выделения глутамата под действием серотонина. Заметив, что присутствие циклического АМФ и протеинкиназы А не только необходимо, но и достаточно для усиления связи сенсорного нейрона с мотонейронами, мы смогли выявить первые звенья цепи биохимических событий, ведущих к формированию кратковременной памяти (рис. 16–4).
