Третий общий подход к сайленсингу генов заключается в использовании siРНК. Она состоит из коротких двухцепочечных РНК (длиной примерно 20 аминокислот), разделенных на отдельные цепочки. Одна из них связывается с выбранной РНК-мишенью, а затем активирует «ножницы» (Argonaute с его PIWI-РНКазой Н) для вырезания нежелательной РНК.
Все три подхода с самого начала дали повод для больших надежд в части, касающейся разработки соответствующих терапий. А что же сейчас? Имеется большой объем данных относительно механизма «антисмысловой» терапии, рибозимов и siРНК, но нет ни одного разработанного препарата и, конечно же, лекарственных препаратов – лидеров продаж. У всех у них одна и та же проблема: как направить терапевтические нуклеиновые кислоты на специфический сайт-мишень для расщепления в опухолевых клетках, тканях головного мозга, органах. Природой разработана замечательная процедура для достижения этой цели – вирусы! Правы был исследователи, пришедшие к заключению, что нужно попытаться использовать синтезированные или модифицированные вирусы, липосомы, наночастицы или «выпотрошенные» вирусы. На копировании природы основана целая область исследований – бионика. Можно использовать модульный характер вирусов и собрать наиболее ценные вирусные компоненты, «лучшее из мира вирусов», как это назвали авторы, комбинируя гены десятка различных вирусов. Это отличное развлечение в лабораторных условиях, но имеет очень незначительный терапевтический эффект. Мне известен только один такой «антисмысловой» препарат для лечения герпесвируса, а конкретно цитомегаловирусной инфекции глаза. Пациент использует только глазные капли – и никаких вирусов и наночастиц! Первым «антисмысловую» ДНК описал Пол Замечник – «отец “антисмысловой” ДНК». Лишь позднее было признано, что вирусы и бактерии также используют ее в качестве принципа регуляции. Это сделало данный подход еще более привлекательным для биотехнологов – природа создала, а мы можем разработать нечто подобное. Герпесвирусы используют «антисмысловые» нуклеиновые кислоты, чтобы удерживать вирус в латентном состоянии. Кроме того, на этом принципе основано поддержание иммунитета фага Р1 против суперинфекций. Первопроходцами этих исследований были ученые лаборатории Хайнца Шустера Общества Макса Планка в Берлине. Хорошо помню, как в 1994 г. искали белок-репрессор в иммунитете фага Р1, а вместо этого открыли нуклеиновую кислоту. Результаты этой работы опубликованы в журнале Cell.
Неожиданно появились новые возможности в плане использования таких технологий для выключения генов. Полная инактивация гена, «потеря функции» позволяет нам выяснить задачи гена. Нет лаборатории в мире, где бы не использовали такую «антисмысловую» технологию, чтобы понять метаболические пути, развитие заболеваний и рака. Такая технология может использоваться для клеточных культур, в исследованиях на животных, но не в исследованиях с участием людей в качестве добровольцев. И что же в результате? Хорошие исследования, идентификация и «валидация» (подтверждение важной роли) целевых генов.
Кроме того, мы использовали часть ДНК для инактивации ВИЧ, «сайленсер ДНК» вместо сайленсера РНК. ДНК в виде U-образной петли направлена против консервативного участка вирусной РНК в частице и активирует молекулярные «ножницы», вирусную РНКазу Н, что приводит к «суициду» ВИЧ. В 2006 г. в материалах симпозиума в Колд-Спринг-Харбор мы обозначили его как сайленсер ДНК «siДНК». Возможно, это станет защитным средством для женщин как вагинальный микробицид против ВИЧ-инфекций; правда, это долгий и затратный путь.
В настоящее время есть новая технология – четвертая терапевтическая нуклеиновая кислота, выделенная из иммунных систем бактерий. Весь мир увлечен ею!
Бактерии спасают гены от инфицирующего фага путем интеграции его ДНК в их геном. Если схожий фаг проникает в бактерию, его распознает РНК, транскрибированная из первого фага, и механизм разрезания уничтожает новый фаг. Система называется CRISPR/Cas9, где Cas9 – молекулярные «ножницы», нуклеаза, осуществляющая вырезание. Исследователи имитируют такой иммунный ответ путем комбинирования нуклеазы с РНК. РНК называется «направляющая РНК» и имеет две функции: нахождение сайта расщепления с использованием гомологических последовательностей и внесение информации, необходимой для генетических изменений. Кроме того, у РНК есть крючок, на котором держится нуклеаза. Генетические изменения описываются как «правка» («редактирование»). В The New York Times была опубликована новость дня – «Правка ДНК». Следует помнить, что компьютерная команда «Правка» означает «изменение». Целевая ДНК вместе с «направляющей РНК» формируют гибрид ДНК–РНК, и при этом ДНК из него вырезается молекулярными «ножницами» Cas9. Они могут вырезать участки ДНК, а концы соединяются клеткой. Или клетка копирует «направляющую РНК» для редактирования. В отличие от других ДНК-модифицирующих технологий, CRISPR может использоваться для изменения специфических генов без «рекомбинации». И это большое преимущество. К тому же до сих пор не существует соответствующих правил или ограничений. В конце 2013 г. Science и Nature признали это одним из величайших 10 прорывов в науке. У журналистов сразу же сложилось свое ви́дение: можно удалять гены, редактировать (изменять) вирусы, бактерии, растения, генетические дефекты, лечить заболевания – модифицировать все мыслимые системы на планете, включая человека. Возможны любые желаемые модификации ДНК в живой клетке и вообще в организме животного, а фактически единовременно можно осуществлять большое число изменений – просто скомбинировать желаемые изменения последовательности на длинной «направляющей РНК». Клетка будет их копировать. Практически ежедневно появляются новые выпускаемые в промышленных масштабах наборы для максимального упрощения этой процедуры. Компании предлагают вирусы для транспортировки комплексов в клетки. Мне на электронную почту приходит ежедневно по три таких предложения. Я видела, как в геном свиньи вносилось сразу 62 правки с целью ее «очеловечивания», чтобы можно было без иммунного отторжения трансплантировать сердце и другие органы этого животного пациентам. Любой студент может использовать этот метод и изменять геномы клеток или эмбрионов для получения трансгенных животных – это почти не занимает времени, хотя раньше докторантам требовалось до трех лет напряженной работы, которая не всегда увенчивалась успехом. А сейчас процесс занимает три недели.
Редактирование – обычное явление в биологии, а не «изобретение» Google. Такой же механизм присутствует и в археях. У африканских трипаносом также широко распространены редактирование и генетическая вариабельность. В тканях головного мозга эмбриона человека редактирование происходит в 35 раз чаще, чем у обезьян. Так что это естественный механизм. Можно ли бактерии со множественной устойчивостью к лекарственным средствам снова сделать чувствительными к антибиотикам? В настоящее время это одна из самых насущных задач в мире. Специалист по синтетической биологии Тимоти Лу из Техасского технологического института пытается это сделать, инфицируя бактерии фагами для редактирования, чтобы вернуть бактериям чувствительность к антибиотикам. В частности, мишенями являются биопленки, содержащие несколько слоев не очень активно метаболизирующихся бактерий, для чего осуществляется редактирование фагов. Редактирование с использованием CRISPR/Cas9 – самое новое, широко разрекламированное направление в исследованиях. Меня это тоже захватило. Новшество данного подхода – быстрота и простота. Существует 20 типов Cas-подобных «ножниц», имеющих различные специфические свойства, и некоторые из них даже вырезают одноцепочечную РНК. Как они будут использоваться?
