11. Использование вирусов в генной терапии
Вирусы против вирусов
Принцип генной терапии очень прост: природа предоставляет нам вирусы, способные быть носителями онкогенов, а вирусологи заменяют онкогены терапевтическими генами. Таким образом, онкогенные вирусы являются болезнетворными, а терапевтические оказывают лечебное действие. Генная терапия использует принцип, которого придерживаются все вирусы, – перенос генов. В этом заключается основная роль вирусов в процессе эволюции.
Вирусы столь успешны в индуцировании болезней, потому что они размножаются в организме до астрономических чисел, – и вот тут-то возникает проблема, поскольку размножение терапевтических вирусов недопустимо. В этом смысле терапевтические вирусы преуспели гораздо меньше. Такое ограничение задается самим человеком, поскольку реплицирующиеся вирусы могут оказаться опасными. Они могут проникнуть в половые клетки и передаться будущим поколениям. Мы не берем на себя смелость манипулировать генами наших потомков, никому не хочется, чтобы это произошло. Довольно сложно разработать вирусы, которые не реплицировались бы при любых условиях, поскольку вирусы «учатся» очень быстро и часть их может «сбежать». Производимые вирусы должны быть безопасными. В большинстве случаев для целей генной терапии применяют ретровирусы. Однако можно модифицировать и большое количество других вирусов и синтетических вирусов. Вирусы, используемые для генной терапии, являются сложными «дизайнерскими вирусами».
При инфицировании нормальной клетки опухолевый вирус превращает такую клетку в опухолевую, но возможен и обратный процесс – опухолевую клетку можно обработать вирусом – носителем терапевтических генов с целью «излечения» такой клетки, в результате чего она становится нормальной. Терапевтический ген должен быть способен компенсировать мутации, обусловившие злокачественный фенотип опухолевой клетки. Генная терапия может быть показана и для лечения других генетических или метаболических заболеваний. Сложно найти правильный ген и наиболее подходящий вирус. Что касается применения любого вируса, всегда есть определенные за и против. Ретровирусы до сих пор являются наиболее тщательно изученными из всех вирусов, которые можно использовать в качестве терапевтических. Они незаменимы для переноса генов в клетки, особенно в лабораторных условиях. В мире не существует ни одной биомолекулярной лаборатории, где ретровирусные векторы не использовались бы в качестве повседневного инструмента для переноса генов. На самом же деле это не совсем так, поскольку для этого нужна лаборатория второго уровня биобезопасности. Мы располагали помещением, отвечающим таким требованиям, поэтому могли синтезировать широкий спектр различных вирусов для своих коллег. Ретровирусы интегрируются в геном хозяина, что рассматривалось как одно из важных преимуществ, поскольку от вирусов ожидали долговременной эффективности. И все же их эффективность не всегда является долгосрочной, и такие вирусы могут представлять опасность, поскольку интеграция в геном часто представляет собой генотоксическое явление, вызывая локальное повреждение ДНК, которое может индуцировать развитие рака как отдаленное последствие терапии. Поэтому лечение рака может вызвать развитие других видов рака. Но даже при этом подобная терапия позволяет пациенту выиграть время и улучшить состояние здоровья.
Совершенно неожиданно результаты доклинических исследований ретровирусов показали, что экспрессия терапевтических генов не всегда носит долгосрочный характер и со временем угасает, несмотря на интеграцию. Это вызвано реакцией организма на инородный ген и ведет к его отключению. Явление, при котором «инородные» гены инактивируются противовирусной защитой, называется сайленсингом. Защита обусловливает эпигенетические изменения, направленные на инактивацию генов, что было описано при исследовании генов цвета у кукурузы и мышей (этот процесс предусматривает метилирование ДНК-последовательностей и другие процессы, направленные на инактивацию генов). Данный механизм сайленсинга, очевидно, носит более выраженный характер у взрослых, поскольку применение генной терапии с использованием ретровируса для лечения детей с гранулематозом (заболевание кровеносных сосудов) привело к их исцелению, в то время как один взрослый пациент через два года умер. В такие исследования включается очень незначительное число пациентов, и объем статистических данных не удовлетворяет соответствующим требованиям. Однако вполне возможно, что терапевтический эффект у детей более долгосрочный, чем у взрослых.
Существуют альтернативные варианты: вместо того чтобы замещать гены, пораженные заболеванием, генную терапию можно проводить путем стимуляции иммунной системы пациента, чтобы помочь ему бороться с опухолью, то есть «помочь людям помочь себе». Иммунная терапия может предусматривать использование генов, кодирующих цитокины, что приводит не к местному, а к системному эффекту. Мы использовали такой фактор, интерлейкин 12 (еще его называют фактором, стимулирующим Т-клетки), который активирует клетки-киллеры, повышая уровень некоторых типов интерферона, – это целая комбинация компонентов, направленных на борьбу с раком.
Самое важное ограничение в плане использования вирусов заключается в том, что они не должны реплицироваться. Вирус не должен переходить из одной клетки в другую.
Каждая клетка – тупик для терапевтического вируса, он может в нее войти, но не может выйти. Вирусы следует вводить в соматические клетки – особенно раковые и в клетки, пораженные заболеванием, – чтобы уничтожить или излечить их, но нельзя допустить, чтобы эти вирусы оказались в кровотоке, откуда они случайно могут попасть в половые клетки и передаться следующим поколениям. Шанс попадания вируса в половые клетки повышается, если вирус активно реплицируется. Такое развитие событий строго запрещено, и изначально это пошло от ученых-исследователей, придерживающихся принципа самоограничения. В настоящее время соответствующими регуляторными органами введены строгие правила . При отсутствии репликации для каждой опухолевой клетки требуется по одному терапевтическому вирусу. Это сложно. Размер опухоли определяется в кубических сантиметрах (это 1 мл или примерно 1 г), в каждом содержится около 109 клеток. Следовательно, если каждый вирус обнаруживает одну клетку, для лечения такой опухоли потребовалось бы как минимум 109 вирусов. Однако возможна выработка не более чем 1/100 или 1/1000 от этого числа (20 млн вирусов в 1 мл). Поэтому потребуется слишком большой объем введения, и, кроме того, вирусы достигают не всех опухолевых клеток. Это объясняет ограничения генной терапии с использованием вирусных векторов, так как для обеспечения эффективности необходима репликация вирусов. Именно для этого их и создала природа. Более того, невозможно добраться до каждой из клеток, поэтому всегда имеет место «минимальное остаточное заболевание». Если сохраняется даже немного раковых клеток, этого зачастую бывает достаточно для увеличения их числа и возвращения опухоли.
Чтобы не допустить производства способных к репликации вирусов, их часто разрезают на части, их гены фрагментируют на 3–4 субвирусные генетические части вместо одной, а затем «упаковывают» в вирусную частицу. Эти части состоят из плазмидной ДНК, и каждая из них может кодировать ограниченный комплект генов. Лентивирусы были созданы для замены более простых ретровирусов. Они являются родственниками ВИЧ. На первый взгляд это кажется устрашающим, но только для читателя и для регуляторных органов. У лентивирусов есть определенные преимущества, поскольку они проявляют активность в неделящихся клетках (в частности, в нейронных клетках). Их можно сделать безопасными. Существуют способы обеспечить такую безопасность путем удаления некоторых генов вирусов или фрагментации и поиска разумных способов предотвратить их превращение в полноценный инфицирующий вирус. На какое-то время эти фрагменты можно соединять и использовать для инфицирования опухолей, и при этом каждая частица поражает одну клетку. Эту систему разработал лауреат Нобелевской премии Дэвид Балтимор из Калифорнийского технологического института (Пасадена).
