Примерно то же самое наблюдалось и в данном случае. Повышение концентрации тиамин-пирофосфата в клетках гриба приводит к снижению производства белков, ответственных за синтез тиамина. Было показано, что если удалить из соответствующих генов участки, похожие на бактериальные РНК-переключатели, то производство тиамин-синтезирующих белков перестает зависеть от концентрации тиамин-пирофосфата.
Таким образом, стало ясно, что участки грибных генов, похожие на РНК-переключатели, действительно являются таковыми. Оставалось лишь выяснить механизм их действия, то есть понять, как они блокируют работу «своих» генов. У бактерий РНК-переключатели делают это либо на этапе транскрипции (первичного «прочтения» гена), либо на этапе трансляции — синтеза белка на матрице мРНК.
У эукариот, как выяснилось, дело обстоит иначе — работа гена блокируется на этапе сплайсинга. Бактериям это недоступно, поскольку у бактерий сплайсинга нет (почти нет, если быть точным). Тиаминовый РНК-переключатель в генах Neurospora crassa располагается в первом интроне, недалеко от начала гена. Если в клетке мало тиамин-пирофосфата, РНК-переключатель «приклеивается» одной из своих петель к строго определенному месту на молекуле мРНК. Это место является одним из потенциальных мест сплайсинга, то есть именно здесь в ходе сплайсинга молекула мРНК может быть разрезана. Однако приклеившийся РНК-переключатель не позволяет этого сделать, и молекула разрезается в другом подходящем месте по соседству. В результате формируется «правильная» зрелая мРНК, на основе которой синтезируется полноценный белок.
Если же в клетке много тиамин-пирофосфата, это вещество присоединяется к РНК-переключателю и изменяет его форму. Переключатель «отклеивается» от места сплайсинга и перестает его защищать. Тогда молекула РНК режется именно в этом месте, которое раньше прикрывалось РНК-переключателем. Это в конечном счете приводит к формированию «бракованной» зрелой мРНК, на базе которой полноценный белок синтезировать невозможно.
Таким образом, РНК-переключатель в зависимости от концентрации тиамин-пирофосфата направляет сплайсинг по одному из двух альтернативных путей.
На этом рисунке показано, как РНК-переключатель регулирует альтернативный сплайсинг у розовой хлебной плесени (на примере гена NMT1). Участок мРНК, вырезаемый при сплайсинге, отмечен пунктирными линиями и серыми стрелками. При низкой концентрации тиамин-пирофосфата РНК-переключатель «защищает» потенциальный сайт (место) сплайсинга, отмеченный значком в виде буквы «Т». В результате при сплайсинге вместо этого сайта используется другой, расположенный по соседству (серая стрелка). Участок мРНК, отмеченный белым цветом, не попадает в зрелую мРНК. При высокой концентрации ТРР это вещество связывается с РНК-переключателем и меняет его конфигурацию. В результате молекула РНК режется в том месте, которое раньше было прикрыто РНК-переключателем, белый участок попадает в зрелую РНК и «портит» ее.
Судя по некоторым косвенным признакам, регуляция сплайсинга при помощи РНК-переключателей может быть довольно широко распространена у эукариот. Чтобы проверить это предположение, необходима разработка эффективных методов поиска РНК-переключателей в эукариотических геномах — эти методы пока еще далеки от совершенства.
Еще одна неожиданная функция РНК обнаружилась недавно в ходе изучения механизмов репарации — починки повреждений в ДНК. Оказалось, что молекулы РНК могут играть роль матриц, информация с которых переписывается в поврежденную молекулу ДНК взамен утерянной
[109]. Процесс основан на обратной транскрипции (как мы помним из предыдущей главы, так называют переписывание информации из РНК в ДНК, то есть синтез ДНК на РНК-матрице). Изобретение обратной транскрипции, между прочим, должно было стать важным переломным моментом в развитии РНК-мира, поскольку позволило РНК-организмам перейти к хранению наследственной информации в более надежной и стабильной форме молекул ДНК. В предыдущих главах мы упоминали несколько случаев использования обратной транскрипции современными организмами: это перемещение и размножение ретротранспозонов и ретровирусов, образование ретропсевдогенов, восстановление укорачивающихся при каждом клеточном делении кончиков хромосом — теломер. И вот еще один пункт добавился к этому списку — репарация ДНК.
Если молекула ДНК повреждена — например, подверглась разрыву, — для ее починки необходима матрица, в которой последовательность нуклеотидов соответствует исходному, «правильному» состоянию поврежденного участка. Ранее считалось, что в качестве таких матриц всегда используются другие молекулы ДНК.
Потом выяснилось, что иногда эти ДНК-матрицы синтезируются путем обратной транскрипции на основе РНК при участии ретротранспозонов.
Наконец, совсем недавно ученые из Национального института экологии здоровья (США) сумели показать, что репарация возможна и непосредственно на основе РНК-матриц без предварительного изготовления ДНК-матрицы и без участия специфических ферментов — обратных транскриптаз, кодируемых ретротранспозонами.
Исследователи искусственно вызывали у дрожжей разрыв хромосомы в одном и том же строго определенном месте. Затем в клетки добавляли искусственно синтезированные короткие молекулы РНК, последовательности нуклеотидов в которых соответствовали участкам поврежденной хромосомы по краям разрыва. Оказалось, что эта процедура повышает вероятность успешной «починки» разорванной хромосомы в 500 раз.
Два основных способа «починки» разрывов двойной спирали ДНК. Первый способ (негомологичное соединение концов) чреват неточностями — потерей или вставкой лишних нуклеотидов в районе разрыва. Второй более точен, но требует наличия «запасной копии» поврежденного фрагмента ДНК. Как выяснилось, эта запасная копия не обязательно должна быть двухцепочечной ДНК (как показано на рисунке), годится и одноцепочечная ДНК и даже РНК.
Если в середину молекулы РНК, служащей матрицей для репарации, ввести несколько лишних нуклеотидов, они потом обнаруживаются в «починенной» хромосоме как раз между сшитыми краями разрыва. Это свидетельствует о синтезе ДНК на матрице РНК, то есть об обратной транскрипции.
Кроме того, это говорит об отсутствии принципиальных преград для переписывания информации из РНК в ДНК в живых клетках, что может иметь большое значение для эволюции. Уже целый ряд фактов указывает на то, что молекулы РНК иногда могут служить чем-то вроде «резервных копий» особо важных «файлов», записанных в геномной ДНК, и при потере каких-то фрагментов информации (даже целых генов!) эти резервные копии могут идти в ход. Мы уже знаем три таких примера (описанные в главе «Управляемые мутации» геномные перестройки у инфузорий, парамутации, участие РНК в репарации), а есть и другие, не поместившиеся в эту книгу. Ясно, что все это открывает большие возможности для эволюции, хотя о том, в какой мере и для чего именно они используются, мы пока можем только гадать.
