На протяжении нескольких лет наиболее серьезную конкуренцию для Illumnia составляла компания Life Technologies, которая приобрела небольшую бостонскую фирму Agencourt и взялась за разработку альтернативного метода секвенирования. В отличие от Illumnia и большинства других конкурентов, работавших с ДНК-полимеразой, в основе системы SOLiD использовалась ДНК-лигаза. Командой секвенаторов SOLiD руководил Кевин Маккернан, умный словоохотливый энтузиаст-биотехнолог, который по иронии судьбы ранее выступал конкурентом предшественника Life (Applied Biosystems). Это было в те годы, когда он когда работал в команде Эрика Ландера на проекте «Геном человека». Система секвенирования SOLiD конкурировала непосредственно с HiSeq. В течение года с небольшим Маккернан и Флэтли упражнялись в немного ребяческой пикировке мнениями, выпуская пресс-релизы в духе «у меня точно как у тебя, но на один больше». Тот факт, что штаб-квартиры обеих компаний – LifeTechnologies и Illumnia – располагались в районе Сан-Диего, лишь распалял их соперничество.
Пока многие академические лаборатории, в том числе Бэйлорский геномный центр Ричарда Гиббса, осваивали приборы SOLiD, на тот момент компании Life не удавалось выдавить Illumnia с ее лидерских позиций. В 2010 году Life сменила курс, рискнув по-крупному: она выделила около 725 миллионов долларов на поддержку новейшей компании Джонатана Ротберга Ion Torrent Systems. После ухода из компании 454 Ротберг продолжал разрабатывать альтернативные варианты секвенирования. Он придумал хитроумный метод, суть которого заключалась в следующем: метод основан на связи между химической и цифровой информацией, что позволяет быстрее и проще секвенировать большое количество образцов. Эта технология также называется рН-индуцированным секвенированием. Процесс основан на детекции протонов, которые получаются при синтезе цепи ДНК как побочный продукт. Как следствие, рН раствора меняется, что и можно детектировать. Платформа Ion Torrent отличается от остальных технологий секвенирования тем, что в ней не используются модифицированные нуклеотиды и оптические методы. Метод Ion Torrent позволяет исследовать транскриптомы, малые РНК. Платформа Ion Torrent позволяет считывать последовательность ДНК гораздо дешевле, чем другие имеющиеся инструменты, работа которых связана с использованием мощных лазеров и дорогих камер.
Когда воодушевленный Ротберг представил аппарат Personal Genome Machine в переполненной аудитории на конференции по геномике в 2011 году, он даже заявил, что еще вчера эта машина секвенировала ДНК прямо у него в гостиничном номере, хотя это, возможно, противоречило указаниям FDA. Двое коллег Ротберга водрузили прибор на сцену, чтобы продемонстрировать, насколько (относительно) мобильна эта машина. Аппарат Ротберга, стоивший каких-то 50 тысяч долларов, был призван демократизировать секвенирование – и это в какой-то степени удалось. Продажи росли благодаря заманчивой перспективе, что каждое последующее поколение чипов в основе системы позволит экспонентно повышать темпы секвенирования. В результате состязание за победу в деле инновационного секвенирования превращалось в гонку двух фаворитов – Illumnia и LifeTechnologies; компания 454 проигрывала конкуренцию, а замыкала этот дивизион компания Roche.
Однако «гонка секвенаторов», несомненно, должна была пройти еще немало зигзагов и поворотов. Более двух десятилетий исследователи работали над, казалось бы, простой новой концепцией: дело в том, что при протягивании ДНК через бактериальные белковые мембраны, образованные естественным образом и именуемые нанопорами, можно определять последовательность нуклеотидов. Впервые эту идею сформулировал химик Дэвид Димер из Калифорнийского университета в Санта-Крусе, обрисовавший такую систему в 1989 году на листе желтоватой линованной бумаги.
Через несколько лет Димер совместно с Дэном Брэнтоном из Гарварда опубликовал результаты исследования, подтверждающие эту концепцию. «При условии дальнейшей доработки этот метод, в принципе, мог бы обеспечить непосредственное и высокоскоростное обнаружение последовательности оснований в отдельно взятых молекулах ДНК или РНК», – прогнозировали авторы, в то время как коллеги еще только готовились к первым черновым работам по секвенированию человеческого генома.
Спустя чуть более десяти лет британский химик и специалист по нанопоровому секвенированию оксфордский профессор Хаган Бейли основал компанию Oxford Nanopore Technologies. Компания пригласила на работу двух «ветеранов» из Solexa: Клайва Брауна и Джона Милтона, – которым было поручено разработать технологии: от компьютерных и программных систем до создания самих нанопор и других компонентов. Работа в значительной степени базировалась на идеях, сформулированных Димером и Брэнтоном еще в 1990-е годы: проделываем белковую нанопору в плоской полимерной мембране, так что ДНК может проникнуть через мембрану лишь сквозь эту крошечную нанопору. Пропускаем через мембрану электрический ток и измеряем сопротивление (изменение тока) за период времени. ДНК проскальзывает сквозь эту пору со скоростью, стремящейся к 500 основаниям в секунду. Далее задействуем хитрую информатику – например, такой инструментарий, как рекуррентные нейронные сети, – чтобы идентифицировать конкретные основания исходя из результатов измерения тока.
В 1989 году Дэвид Димер схематически изобразил идею нанопорового секвенирования ДНК
Разумеется, будь все так просто, Oxford Nanopore – либо одна из конкурирующих компаний – стала бы известна в каждом доме. На самом деле ученым из компании предстояло методом проб и ошибок отмести множество стратегий, прежде чем остановиться на системе, применяемой в настоящее время. Исходная идея, которую окрестили «срежь и брось», была связана с использованием фермента под названием экзонуклеаза. Фермент отхватывает отдельные нуклеотиды с хвостового конца последовательности ДНК, примерно как «Пакман», после чего эти фрагменты один за другим проходят через пору, расположенную снизу. Но эта идея оказалась провальной; от нее отказались и стали пропускать через пору цельную ДНК, используя другой фермент, расплетающий двойную спираль.
Замечательный прибор-секвенатор от компании Oxford Nanopore. Фермент расплетает двойную спираль, и одиночная нить ДНК, извиваясь, проходит сквозь центральную пору бактериального нанопорного белка. Анализ флуктуаций электрического тока позволяет идентифицировать конкретные основания, проникающие через пору
Секвенатор сильно уменьшился: Oxford Nanopore планирует запустить производство прибора SmidgION, который буквально вставляется в смартфон, как флешка
Возможно, наиболее революционное достижение оксфордской технологии – сам прибор. Это крошечное мобильное устройство не больше смартфона, которое подключается к ноутбуку через обычный USB-кабель.
