Реакция нейтрализации вирусов основана все на том же связывании антител с вирусами – смесью вируса и сыворотки заражают культуру клеток, куриный эмбрион или лабораторное животное и наблюдают последствия. При положительной реакции, то есть при нейтрализации вируса антителами, зараженные организмы продолжают нормально существовать, а в случае их гибели реакция считается отрицательной, поскольку вирус не совпал с антителом и не был блокирован. Эта реакция может проводиться как с заведомо известным вирусом и неизвестным исследуемым антителом, так и наоборот.
Реакция преципитации в геле
[46] основана на выпадении комплекса антигена с антителом в осадок, один из компонентов реакции (обычно – сыворотка), находится в агаровом геле, а другой (обычно – антиген, вирус) наслаивается на гель в виде раствора. Растворенный антиген, проникая в гель, связывается в нем с антителами и образует белые линии осадка или линии преципитации; можно поступить иначе – вырезать в геле лунку и налить туда сыворотку, а вокруг нее устроить лунки с различными антигенами, между лунками, содержимое которых прореагирует друг с другом, появится полоса преципитации. Проведение реакции преципитации в геле, а не в жидкости, позволяет получить больше данных и количественно проанализировать содержание антигенов и антител. Кроме того, в жидкости преципитат может распасться от легкого встряхивания, а на геле он получается стойким. Благодаря высокой чувствительности и простоте постановки, эта реакция используется очень часто. К недостаткам ее можно отнести трудности с получением антигена в некоторых случаях, когда собственные антитела зараженного организма блокируют антиген.
[47]
Радиоиммунный анализ основан на применении антигенов или антител, меченых радионуклидами. После взаимодействия антигенов с антителами отделяют образовавшийся радиоактивный комплекс и определяют его радиоактивность в соответствующем счетчике, оценивающем интенсивность бета– или гамма-излучения (интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигенов и антител). Радиоактивная метка очень удобна. Она не только делает комплексы антиген-антитело хорошо заметными, но и позволяет производить точный их подсчет. Этот вид анализа отличается высокой чувствительностью и специфичностью. Но есть у него и недостатки, такие, например, как недолговечность хранения меченого объекта и необходимость высокой очистки реактивов.
[48]
[49]
Иммуноферментный анализ похож на радиоиммунный, только в качестве метки, облегчающей регистрацию комплексов антигенов с антителами, в данном случае используются не радионуклиды, а молекулы определенных ферментов. Выявление метки производится с помощью индикаторов, изменяющих свою окраску.
На сегодняшний день популярность методов иммуноферментного анализа возрастает, поскольку они отличаются высокой специфичностью и удобны в использовании. Но это довольно дорогостоящий метод, а цена вопроса всегда имеет значение.
Наиболее перспективными считаются генетические методы вирусной диагностики. И это не случайно, ведь нуклеиновые кислоты являются чем-то вроде паспорта для любого организма, причем подделать этот паспорт невозможно.
Метод гибридизации, или метод ДНК-зондов, может применяться для выявления определенных фрагментов нуклеиновых кислот. Этот метод основан на комплементарности ДНК (вспомните, что это такое). ДНК-зонд представляет собой одноцепочечные (разделенные надвое) молекулы ДНК, меченые изотопом или ферментом. Если зонд и молекула нуклеиновой кислоты (РНК или одноцепочечной ДНК) вируса окажутся комплементарными, то между ними произойдет гибридизация – лежит способность однонитевых молекул нуклеиновых кислот вступать во взаимодействие с комплементарными нитями и образуется двухнитевая гибридная молекула. Гибридизацию можно сравнить с открыванием замка ключом. Замок откроется лишь в том случае, если ключ к нему подходит. Ошибки исключаются.
ДНК-зонды образуются при помощи так называемой полимеразной цепной реакции, в ходе которой фермент ДНК-полимераза создает множество копий нужных фрагментов молекул ДНК.
Звучит все это невероятно духоподъемно. Воображение рисует волшебные картины создания копий ДНК. Ученые в противочумных (а почему бы и нет?) костюмах при помощи особых инструментов, глядя в электронный микроскоп, растягивают в линию молекулу ДНК, радиоактивным маркером размечают на ней нужные участки…
Стоп! Давайте вернемся в реальность, которая иногда бывает круче любой игры воображения, но в данном конкретном случае она прозаична до невозможности.
Копирование фрагментов ДНК осуществляется при помощи аппарата, который называется амплификатором (размером он примерно с мультиварку). Принцип работы амплификатора заключается в обеспечении периодического охлаждения и нагревания помещенных в него пробирок с точностью до 0,1 °C. Изменение температуры нужно для управления полимеразной цепной реакцией.
В пробирку закладываются копируемая ДНК, свободные нуклеотиды – материал для синтеза копий, ДНК-полимераза и так называемые праймеры – инициаторы синтеза ДНК. Праймер – короткий фрагмент нуклеиновой кислоты, состоящий из нескольких нуклеотидов, – представляет собой концевой обрывок синтезируемого фрагмента ДНК. Для каждого фрагмента нужно два праймера – начальный и конечный. Они прикрепляются к молекуле ДНК, ограничивая участок работы ДНК-полимеразы. Проще говоря – праймеры указывают ДНК-полимеразе: «работай отсюда досюда!».
Как праймеры прикрепляются к молекуле ДНК?
Сами собой, по принципу комплементарности, достаточно только поместить их в одну пробирку с молекулами ДНК.
ДНК-полимераза начинает присоединять праймеру нуклеотиды, создавая фрагмент молекулы ДНК. Этот процесс тоже происходит сам по себе, главное, чтобы в пробирке имелись необходимые нуклеотиды. Генные инженеры могут в это время пить кофе и рассказывать анекдоты.
Вместо ДНК-зонда может использоваться РНК-зонд. Суть одна и та же – одиночные цепи нуклеиновых кислот могут соединяться друг с другом только при их полной и абсолютной комплементарности. Ключ или подходит к замку полностью, или не подходит к нему совсем.
«Qui bene diagnoscit bene, curat» – «кто хорошо диагностирует, тот хорошо лечит», говорили в Древнем Риме. Надо сказать, что диагностировать присутствие вирусов в организме врачи умеют хорошо. Еще бы научиться столь же эффективно их уничтожать…
