В исследовании, результаты которого были опубликованы в сентябре 2019 года в журнале Cell (Gokhman et al., 2019), ученые использовали метилом денисовского человека для реконструкции его облика (илл. IX на цветной вклейке). Метод, который они для этого разработали (рис. 4.3), основан на допущении, что фенотипические изменения, вызываемые сильным метилированием промотора, похожи на те, что возникают в результате мутаций, нарушающих работу данного гена или вовсе выводящих его из строя. Это правдоподобное допущение, потому что в обоих случаях функциональность соответствующего белка резко снижается.
В работе использовались метиломы денисовца (все той же девочки Denisova 3), двух неандертальцев (алтайского из Денисовой пещеры и хорватского из пещеры Виндия), пяти древних сапиенсов, живших от 45 до 7,5 тыс. лет назад, а также метиломы костей (это важно, ведь в разных тканях профили метилирования различаются!) пяти шимпанзе и пятидесяти пяти современных людей.
Первый этап исследования состоял в выявлении участков генома, уровень метилирования которых четко различается у разных видов (DMR, Differentially Methylated Regions). Учитывались только те участки, уровень метилирования которых мало зависит от возраста, пола, состояния здоровья и типа кости, а зависит только от видовой принадлежности. Такие DMR с большой вероятностью отражают именно эволюционные (а не возрастные, половые, тканеспецифичные или средовые) изменения уровня метилирования. Кроме того, рассматривались только самые сильные изменения. Отобранные для анализа участки должны были включать не менее 50 цитозинов, подходящих для метилирования (метилируются обычно цитозины, стоящие в ДНК перед гуанинами), и различаться у разных видов как минимум на 50 процентных пунктов: например, 80 % метилированных цитозинов у одного вида и лишь 30 % у другого. Для сравнения: колебания параметров среды обычно меняют уровень метилирования тех или иных участков генома не более чем на 10 %. Наконец, из всех DMR, удовлетворяющих этим условиям, для дальнейшего анализа были выбраны те, что расположены в промоторных областях белок-кодирующих генов (на расстоянии от 1 до 5 тысяч пар оснований от точки начала транскрипции), поскольку известно, что метилирование цитозинов именно на этих участках сильнее всего коррелирует с экспрессией гена.
Рис. 4.3. Метод реконструкции фенотипа по данным о метилировании промоторных областей генов. Сначала выявляются гены, в промоторных областях которых у интересующего нас вида – в данном случае у денисовца – сильно изменился уровень метилирования по сравнению с ближайшими родственниками (неандертальцами и сапиенсами). Затем на основании данных по современным людям – носителям мутаций, выводящих данный ген из строя, делаются выводы, к каким фенотипическим изменениям могло привести изменение метилирования. При этом учитывается, что гиперметилирование промотора обычно ведет к снижению экспрессии гена, поэтому фенотипический эффект может быть похож на эффект мутации, ведущей к потере функции. Разработанный метод испытывается на видах с известной морфологией (неандертальцах и шимпанзе) и, наконец, используется для реконструкции морфологии денисовца. По рисунку из Gokhman et al., 2019.
После применения всех фильтров в изучаемой выборке DMR осталось 154 участка, уникальных для современных людей (то есть метилирование которых изменилось у сапиенсов по сравнению с другими гоминидами), 171 – метилирование которых изменилось у общих предков неандертальцев и денисовцев после их отделения от сапиенсов, 113 – специфичных для неандертальцев, 55 – специфичных для денисовцев, а также 2031 – по которым шимпанзе отличаются от всех видов людей. Для подавляющего большинства генов, в промоторах которых находятся отобранные DMR и по которым есть данные о корреляции между метилированием и экспрессией, эта корреляция отрицательна, то есть гиперметилирование соответствует пониженной экспрессии или полному отключению гена, а гипометилирование – высокой активности гена. Исключения из этого правила существуют, и они учитывались исследователями при разработке метода.
Чтобы на основании данных по DMR предсказывать морфологию, ученые использовали базу данных HPO (Human Phenotype Ontology), где содержится самая надежная и полная на сегодняшний день информация о том, как вредные мутации, ведущие к потере функции белка, сказываются на фенотипе. Из базы HPO были выбраны только те фенотипические изменения, которые, во-первых, затрагивают скелет, а во-вторых, имеют направленность. Например, “нарушение развития тазовых костей” не подходит под это условие, потому что не имеет направленности, а “укороченные подвздошные кости” – подходят. Всего в базе HPO удалось найти данные по 815 направленным изменениям скелета, которые наблюдаются у людей при поломке того или иного гена.
Эти данные опробовали на “предсказании” фенотипов двух видов с уже известной морфологией – неандертальцев и шимпанзе. Казалось бы, метод просто не может работать, ведь он основан на невероятно смелых допущениях и упрощениях! Тем не менее реконструкции шимпанзе и неандертальцев получились удивительно похожими на реальные. Например, неандертальцы отличаются от сапиенсов, как подсчитали авторы, по 107 признакам строения скелета. По метилому удалось “предсказать” больше половины (62) из этих отличительных признаков. В 46 случаях из 62 удалось предсказать не только сам признак, по которому неандертальцы отличаются от сапиенсов, но и направленность различий, причем в 36 случаях – правильно. Примерно такие же результаты получились и для шимпанзе.
Таким образом, метод оказался довольно эффективным, что вообще-то странно, учитывая, что метилирование промоторов – хотя и важный, но далеко не единственный способ регуляции активности генов. Отчасти успех может объясняться тем, что разные способы такой регуляции (включая метилирование ДНК, модификации гистонов и прикрепление регуляторных белков – факторов транскрипции – к регуляторным участкам ДНК) часто действуют согласованно, так что по одним признакам, указывающим на повышенную или пониженную активность гена, можно судить и о других. Иными словами, если мы видим, что у гена гиперметилирован промотор, то можно ожидать, что найдутся и другие признаки снижения активности гена, если их поискать.
Убедившись, что метод работает, ученые использовали его для реконструкции морфологии денисовского человека. Удалось выявить 56 отличий денисовцев (точнее, одного денисовца – все той же девочки Denisova 3) от неандертальцев и (или) современных людей. Направленность различий была предсказана в 32 случаях. Результаты по 18 признакам строения черепа (и 23 отличиям) суммированы на рисунке 4.4.
Получилось, что по большинству признаков, отличающих денисовца от современных людей, денисовцы были сходны с неандертальцами (мощные челюсти, низкий череп с широким основанием, низкий лоб, толстая зубная эмаль, широкий таз, крупная грудная клетка, расширенные кончики пальцев). При этом у денисовцев, в отличие от сапиенсов и неандертальцев, увеличен размер головки нижней челюсти, ширина черепа в теменной части и длина зубной дуги (последний факт согласуется с тем, что найденные денисовские зубы действительно очень крупные).
