Илл. 17. Сформулированный Рудольфом Вирховом принцип omnis cellula a cellula («любая клетка происходит из клетки») не только произвел революцию в учении о болезнях и биологии развития, но и для самого исследователя был настолько важен, что тот поместил его на своем экслибрисе
Чисто теоретически природа могла найти и другое решение. Существуют клетки, которые прошли дифференцировку, но сохранили способность делиться, и можно представить себе, как в случае необходимости запасы могли бы обновляться или восполняться с их помощью. Например, так это устроено в печени. С другой стороны, нейроны снабжены сильно разветвленными отростками, а через их мембрану проходят электрические импульсы. Трудно представить себе, как должна делиться клетка с такими свойствами. Их называют «постмитотическими», потому что их последнее деление (митоз) безвозвратно прошло.
Когда способность к делению сохраняет небольшая группа клеток, изолированная при этом от других, это также повышает надежность. Неконтролируемое деление клеток – не что иное, как рак. На самом деле некоторые современные теории канцерогенеза утверждают, что образование опухоли начинается со сбоя в стволовых, а не в дифференцированных клетках. Неясно, относится ли это ко всем видам рака, но в случае опухолей мозга данная теория объяснила бы многие особенности, которые в противном случае остаются загадкой. Таким образом, ограничение способности делиться обеспечивает лишь частичную защиту. Но это также показывает, что, если бы активно делиться при необходимости могли все клетки тела, риск был бы несоразмерно больше.
Итак, способность к делению – это хороший, но не обязательно однозначный признак стволовых клеток. Долгое время, однако, он был единственным. На способности и потребности делиться, которой обладают стволовые клетки, в результате чего в них встраивается меченный радиоактивным водородом тимидин (тогда как готовые нейроны остаются постмитотическими), основан метод, с помощью которого Альтман доказывал существование нейрогенеза взрослых. В версии с использованием БДУ его применяют до сих пор. Достоверность этого метода выросла, когда удалось подключить дополнительные критерии, чтобы подтвердить, что делятся при этом именно стволовые клетки.
Как исследуют стволовые клетки: о сферах и слоях
Для этого нужно показать, что потенциальные стволовые клетки способны к самообновлению и мультипотентны. Это не так просто, особенно если оба критерия требуется подтвердить прямо в мозге. Для начала следовало бы выявить эти свойства на изолированных клетках. Даже по животным в зоопарке (тоже изолированным) можно многое узнать об их виде. Но все-таки не все, и в первую очередь – ничего о том, как они взаимодействуют со своей естественной средой. Тем не менее именно такое описание стволовых клеток в «условиях зоопарка» клеточной культуры удалось выполнить в начале 90-х, тем самым ощутимо восполнив пробелы в наших знаниях.
Рейнольдс и Вейс сумели сделать это на стволовых клетках из стенки желудочка мозга. Для этого они выделили клетки, положили в посуду для культивирования с питательной средой и создали еще некоторые условия, о которых они могли предположить, что стволовым клеткам те бы понравились. Во многом это было сделано наугад. Работа с клеточными культурами – это своего рода магия, или, лучше сказать, ремесло. В любом случае здесь этого больше, чем чисто теоретических научных принципов.
Как бы то ни было, попытка удалась, и вскоре в среде плавали отдельные маленькие комочки, так называемые нейросферы, которые при этом довольно быстро росли (см. рис. 17 на вклейке). Когда клетки в этих сферах разъединили, все пошло заново, и с клетками следующего поколения, когда их вновь разъединили, произошло то же самое. Из отдельных клеток все время получались сферы, довольно неоднородные скопления, и отдельные клетки в них были способны к формированию новых разнородных сфер. Эта способность, которая сохранялась из поколения в поколение, – ни больше ни меньше чем признак самообновления. А неоднородность таких скоплений клеток говорит об их мультипотентности.
Исследуя гиппокамп, Палмер и Гейдж пошли другим путем. Они не давали клеткам свободно плавать, а нанесли на лабораторную посуду слой, к которому те могли прикрепляться. Логика в том, что в организме клетки тоже не перемещаются туда-сюда сами по себе и, естественно, всегда ищут, где остановиться. То же самое они делают в сферах, поэтому и слипаются друг с другом. Таким образом они создают свое собственное окружение. Но при этом они перестают плавать по отдельности, и вскоре становится невозможно разобрать, что происходит. В так называемых адгезивных культурах клетки тоже находятся в контакте, но не столько друг с другом, сколько с лабораторной посудой. Они дольше остаются разъединенными, их проще исследовать как отдельные сущности. Преимущество здесь в том, что культуры остаются более чистыми. С другой стороны, возникает ситуация, далекая от условий организма.
Продемонстрировать самообновление клеток в адгезивной культуре несколько сложнее, зато можно совершенно отчетливо показать, что они дифференцируются и превращаются в клетки различных типов (мультипотентность). Тем не менее Палмер и Гейдж именно таким образом подтвердили, что в гиппокампе взрослых, для начала крыс, есть стволовые клетки.
Некоторое время эти два метода культивирования стволовых клеток – в сферах и в клеточном слое – соперничали. Разразилась дискуссия, похожая на детские ссоры на почве того, что лучше: Mercedes или BMW, ручки Geha или Pelikan, футбольный клуб «Шальке 04» (или теперь уже «Боруссия») или «Бавария» и так далее. Сейчас можно наблюдать мирное сосуществование и даже смешанные формы этих методик. Исследователь стволовых клеток Клив Свендсен назвал эти два типа клеточных культур версиями нейрональных стволовых клеток для ПК и Apple: действуют они примерно одинаково, но не вполне совместимы друг с другом. Тут не хватает только своей системы Linux. У этих двух методов культивирования совершенно разные свойства, и оба они дают лишь приблизительную картину. Ни один из них не идеален. Оба остаются моделями. Но модели очень полезны, особенно если использовать их в сочетании друг с другом. Они незаменимы, когда нужно подтвердить свойства стволовых клеток.
Тем временем удалось продемонстрировать эти клеточные свойства и в самом мозге, что несравнимо сложнее. Аналогично методу БДУ можно инфицировать клетки вирусом, который поражает их только при делении (так называемым ретровирусом). Ученые используют непатогенный вирус такого рода, в геноме которого есть «репортер» – зеленый флуоресцентный белок (сокращенно ЗФБ)
[29]. Этот белок можно заставить светиться под микроскопом. Таким образом удается непосредственно наблюдать инфицированные клетки. Геном вируса встраивается в геном клетки хозяина и передается потомкам при делении. В результате дочерние клетки тоже светятся зеленым. Дочерние и материнские клетки образуют клон. Вводя вирус экономно, чтобы инфицировать лишь совсем немногие стволовые клетки, потом можно исследовать этот клон весь целиком и анализировать в нем различные клеточные типы. Если среди них опять есть стволовые клетки, это говорит о самообновлении, если встречаются дифференцированные дочерние клетки разных видов – о мультипотентности. В теории звучит незамысловато, но на самом деле это сложнейшая техническая задача. Как бы то ни было, этот подвиг показывает, что в мозге взрослых действительно присутствуют полноценные стволовые клетки.
